生物工程是生命科学的重要组成部分,它被认为是主导21世纪产业界的尖端技术。
胚胎移植首次于1890年在兔子上试验成功,直到本世纪30年代以后,才开始大量研究,1951年在牛上试验成功。60年代,英、法、加、美、日等国对牛胚胎的采集、保存、移植等技术环节进行了大量的试验研究。70年代发达国家开始进入奶牛肉牛生产的实际应用阶段。加拿大采用胚移技术生产的荷斯坦小牛是1973年注册的,到1986年已注册18097头,近10年发展更快,并已获准商业化胚胎出口业务[1]。在加拿大,胚移的处理程序已经从临床手术型改良为“农场”非手术型,并已简单化,从而成为一种牛群改良工具。供体一般在农场超排,并由当地人工授精技术人员配种,对一组受体实施同期化,使其和供体同期发情,供体配种后7d左右,就在牛舍里用简单非手术法移植到受体里。1头正常的母牛每次平均可冲卵5枚,在实际现场条件下移植受孕率平均为65%,冷冻胚胎受孕率平均为50%。目前国外牛的手术法鲜胚受孕率为75%,冷胚为60%,非手术法鲜胚受孕率为60%~70%,冻胚受孕率为50%~60%。我国这一技术的起步较晚,1978年在牛上试验成功,80年代在牛的胚胎冷冻和胚胎分害等方面取得成功,近年来在牛胚胎性别鉴定、核移植等技术方面也取得了较大进展。目前,全国许多省份十分重视这项工作,如北京、河北、湖北、山东、宁夏都建立了动物胚胎工程研究中心,广东、广西、陕西、江苏、新疆、内蒙古等地也成立了类似的机构,并投入大量经
胚胎移植的基本过程包括:供体和受体的选择,供体超排处理和配种,受体同期发情处理,胚胎回收与保存,检胚和胚胎移植。
1 超数排卵与卵回收技术
超数排卵技术目前主要采用:①孕马血清(PMSG)+前列腺素法:在发情同期第8~13天肌注1500~3000IU PMSG,2d后注射F2α或氯前列烯醇(ICI80996),在发情开始后12~18h、18~24h各进行一次人工授精。②FSH法:从发情第10天开始,每隔12h用药1次,连用5d,用药量每天递减1mg。这方法比较麻烦,但是回收的卵子数多。影响超排的因素主要有:①遗传差异。据Scanlon报道,一般与品种有关,肉用品种对PMSG的耐受度比奶用品种大。②剂量与反应的关系。早期的研究表明卵泡和排卵的平均数、变异系数似乎随PMSG的剂量增大而增大(Henricks)。大剂量的PMSG会伴发持久卵泡比例的增高。③注射PMSG到发情间隔时间。一般间隔时间在5d左右时,排卵率最高,然而政党发情周期长度不同,给控制注射PMSG到发情的间隔时间造成了困难。目前,主要采用控制发情周期,注射前列腺素F2α及其类似物使黄体迅速溶解,也有报道使用孕激素栓剂或皮下植入SC-21009之前48h应用PMSG[3]。④不同批号激素的效果不同。这一观点已被国内外学者证实,在国外,应用基因工程方法生产的相同批次的FSH和LH改进超数排卵的效果。
冲卵最早采用手术法,自1976年非手术法采卵技术成功后,现在在大家畜上已广泛应用。有人证明三路导管循环法比二路导管来回法对提高胚胎回收率更有效,影响超排卵子回收和受精的因素,一些学者也进行研究。①排卵到回收的间隔时间对回收率的影响。研究认为发情后第3~6天,卵的回收率较高。②超排程度对回收率的影响。Scanlon等报告,随PMSG剂量增加(超过3000IU),卵的加嘏率有降低趋势。③加收卵的受精率对回收率的影响。处理较成功的是从每头牛获得3~5个受精卵,回收卵的受精率一般为50%~80%,变异程度较大,不同的处理组合和剂量,不同的学者报告都不一致。有人证明新鲜精液比冻精受精率高,但该研究头数较少[4]。Newcomb证明用高于平均生育力的受精卵比低于平均生育力的公牛精液授精的受精卵要提高28个百分点左右。目前,关系到胚胎移植效果和应用的关键技术之一就是超数排卵问题,深入研究超数排卵的机理和影响因素、处理程序、改进超排效果,确定在进行超排处理时最适条件(卵泡数目、发情周期所处阶段、内源性激素水平)对结果的影响,发现一种能够替代PMSG或其他激素的化合物,都是一些重要的研究领域。
2 胚胎的保存
人们已经证实10℃保存的鲜胚要比37℃存活时间长,早期胚胎对温度易受损害。胚胎冷冻保存不仅便于胚胎移植的应用推广,而且对遗传资源保存都有重要意义。冷冻保护剂目前有的用二甲基亚砜(DM-SO),有的用甘油。Willadsen采用DMSO,以囊胚期冷冻效果较好,据河北农大试验用甘油作保护剂,生产奶牛冻胚解冻后按A、B、C三级移植,受孕率分别为77.8%、50.0%和19.3%。目前冷冻设备、程序及保护剂,尤其在肉牛上的研究在国内还不多,有待进一步改进提高。
3 胚胎分割
胚胎分割的目的有两个,一个是进行性别鉴别,另一个是增加胚胎利用率,降低生产成本。这一技术的关键就是保护液选择和切割技术。我国在这一领域的研究和应用与世界先进水平接近。据报道,内蒙古采用鲜胚切割的牛胚发育率为80%,冻胚为56.9%,这项技术的研究与应用潜力较大[5]。
4 胚胎性别鉴定
过去采用细胞遗传学、特异性抗原检测,目前采用Y-特异性DNA探针技术,在国内外已开始应用,这项技术要求一定的设备和分子生物学技术,但准确度高,据中国农科院畜牧所罗应荣等报道,应用PCR试剂盒鉴定性别准确率为97.7%,切割取样后的冻胚成功率为45.4%,冷冻胚胎切割取样后移植成功率为38%,略低于全胚成功率,如何缩小这个差距,也是需研究改进的。
5 胚胎移植提高双胎率是肉牛生产的重要技术
英国的Powson等人给仅存一个黄体的子宫角中放入一个受精卵,双胎率达到73%。据河北省胚胎移植研究中心桑润之等报道,把7日龄的冻胚移植到两侧子宫角受孕率61.5%,双胎率50%,移植到一侧受孕率52.2%,双胎率41.7%[6],在这一方面的研究我国与国外还有一定差距。
尽管胚移技术在国外已经是一项比较成熟的技术,但在国内,由于技术、管理上的问题,推广面积小,如内蒙古1993~1997年完成移植肉牛657例[2],河北省移植受体母牛122头,还是推广较好的省份[6]。从胚胎生产角度来看,依靠进口胚胎,势必造成成本太大,不利于推广,国产胚胎因技术、设备落后,质量不移定,也没有形成规模,但成本较低。从胚胎移植技术来看,由于牛的品种个体一致性差,在超排药物种类选择,尤其是适宜剂量等方面掌握的不好。缺乏足够的试验数据,积累的经验还不够。同期发情处理、最佳移植条件的确定与检测、性别鉴定技术的实用化程度等方面都还没有形成配套技术,熟练影响胚胎移植技术推广的重要原因。
我国奶牛平均产奶量为1546kg,而世界奶牛平均产奶量为2010kg,发达国家平均为6000~7000kg,我国肉牛日增重平均1.2kg,而发达国家平均为1.8~2.4kg。我省黄牛改良工作自70年代以来,大力推广黄牛冻配改良,取得了很大成效,但是应用新的繁殖生物技术——胚胎移植技术,扩繁引进的良种肉牛奶牛的群体,加速提高我省肉牛、奶牛的生产水平,提高养牛的经济效益已经显得十分迫切和需要,如何解决胚胎移植的技术问题,以推动这项技术在黄牛改良上的应用,尚需在以下几个方面进行研究:①牛的超数排卵、同期发情及冲卵技术的改进研究,以提高采集有效受精卵的数量;非手术法胚胎移植试验与技术改进,以提高非手术法胚胎移植的受胎率。②胚胎分割技术的试验与应用,以提高胚胎的利用率,降低生产成本。③进行胚胎性别的鉴定,有目的的控制公母群体数量。④胚胎移植双卵技术试验,以提高肉牛生产效益。


