摘要：盐酸克伦特罗，俗名“瘦肉精”，在动物体内能增强脂解和减慢蛋白质分解代谢，具有调节营养物质的流向和重新分配的作用，在畜牧生产中大剂量使用可明显提高饲料转化率和瘦肉率，但其残留在动物组织中，人食用后会对肝、肾等内脏器官产生毒害，甚至引起死亡，已引起国内外的高度重视。本文就目前国内外检测盐酸克伦特罗的主要方法及进展情况进行综述。
关键词：盐酸克伦特罗；瘦肉精；酶免疫分析技术
盐酸克伦特罗(clenbuterol，CLB)，俗名“瘦肉精”，化学名为“2-[(叔丁氨基)甲基]-4-氨基-3，5-二氯苯甲醇盐酸盐”，药品名为“克喘素”，是一种β2-肾上腺素能激动剂。20世纪70年代末，美国等发达国家开始了将CLB用作“营养重分配剂”及“促生长剂”的实用性开发研究；80年代被广泛应用到畜禽生产中。CLB在动物体内能增强脂解和减慢蛋白质分解代谢，具有调节营养物质的流向和重新分配的作用，若在畜牧生产中大剂量使用可明显提高饲料转化率和瘦肉率，因而在畜牧行业被俗称为“瘦肉精”。CLB残留在动物组织中，人食用后会对肝、肾等内脏器官产生毒害，出现心悸、头痛、目眩、恶心、呕吐、心率加快、肌肉振颤等症状，严重者甚至死亡。近年来动物性产品中CLB残留对人类健康造成的危害和对生态食物链所造成的破坏已经引起高度的重视。下面就目前国内外检测CLB的主要方法及进展情况作一综述。
1 样品的选择
CLB在肌肉、肝脏、肺脏、肾脏、眼球的残留量多，残留维持时间较长，但是这些样品预处理过程复杂，难于操作；而CLB在血浆中浓度较低，维持时间短，所以，都不是检测CLB残留的理想样品。但CLB有良好的热稳定性，在体内不会被破坏分解，大量以原形由尿液排出，尿液中CLB的浓度比血浆中高40倍，可实现宰前检测，所以尿液是检测CLB的较好的样品。CLB能特异地与毛发、羽毛中的色素牢固结合，而且残留量大、维持时间长、采集方便，也适合宰前检测，所以毛发、羽毛是检测CLB非法使用最好的样品。因此，建议应用毛样、尿样来检测CLB更为合理和理想。
2 样品前处理
尿样经4500转/分离心10分钟，取上清液可直接用于检测；但是组织样品检测前必须进行复杂的样品前处理，对组织中残留的CLB加以提取、纯化、浓缩。常规方法主要有4种：液－液萃取法、固相萃取法（SPE）、免疫亲和色谱法（IAC）、基质固相分散法（MSPD），其中固相萃取法为许多实验室广泛采用，该法可成批处理样品，实现自动化，溶剂用量少，费时少。
3 检测方法
目前，检测CLB残留的方法主要有四种，即高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱法(CG-MS)、毛细管区带电泳法(CE)和免疫分析技术(IA)。
3.1 高效液相色谱法(HPLC)
HPLC适合测定热不稳定和强极性的β-激动剂及其代谢产物，而且，HPLC可以与柱前提取、纯化及柱后荧光衍生化反应和质谱(MS)等系统联用，容易实现分析过程的自动化。黄士新等(1995)应用紫外检测器，在λ=243nm，色谱柱：shimpackCLC-ODS150×6.0mn，流速：1mL/min，柱温：室温30℃的条件下检测猪肝脏和猪肉中的CLB残留，最低检测限可达2ng/g[4]。国外有人应用HPLC (二极管阵列检测器)测定动物性食品中CLB残留，测得最低检测限为1.26ng/g，回收率达98.9%[5]。目前，我国已将HPLC法作为检测CLB残留的半确证性方法，最低检测限范围为1～15ng/g，其优点是专属性好、选择性强、检测精确度较高，而且假阳性率低；缺点是样品处理时间长，检测过程烦琐、难于操作，需贵重仪器，在实际应用中受到一定的限制。
3.2 气相色谱-质谱法(GC-MS)
GC-MS法优点是把色谱高效快速的分离效果和质谱高灵敏度的定性分析有机合起来，能在多种残留物同时存在的情况下对某种特定的残留物进行定性、定量分析，而且具更高的检测极限。Fente C. A等用GC-MS法检测牛毛中CLB的残留，最低检测限为5ng/g[6]；Pteer Batioens应用气相色谱－串联质谱法(GC-MS-MS)对牛、羊、猪组织中的CLB含量进行检测，最低检测限为2ng/g[7]；刘琪等用GC-MS法（EI离子源）检测猪尿中的CLB，检测限为0.5ng/mL；VanRhijin等用三甲基硅基或2-二甲基硅基吗啉衍生物检测尿提取物中的CLB，衍生物用电脉冲方式或化学离子化方式扫描，会产生更高的灵敏度。另外，GC-MS法与HPLC法相比，检测灵敏度更高，假阳性率更低。因此，我国将GC-MS法定为检测CLB的确证性方法（NY/T468~2001）。
3.3 毛细管区带电泳法(CE)
CE法非常适用于那些难以用传统的液相色谱法分离的离子化样品的分离与分析，其分离效率可达几百万理论塔板数。其优点是：具有很大的灵活性，许多分离参数（如缓冲液的组成和pH值、毛细管的类型以及所使用的电场的波形等）都可以调节，操作简便，所需样品量极少，一般只需几纳升（如Gause-pohl C等应用CE技术检测人尿中CLB的残留，最低检测限达到0.5ng/mL），而且精确度、准确度均已符合生物样品中残留物的检测标准；缺点是检测时间较长，需较复杂的仪器。另外不足之处是目前尚缺乏合适的、配套的检测器，因此，只有研究、开发灵敏度更高的检测系统，CE法的优势才能充分发挥出来。
3.4 免疫分析技术(IA)
标记免疫分析技术是“迈向21世纪的医学检验技术”之一，其发展趋势是：新标记物的发展与联合应用、单克隆以及基因工程抗体的应用及免疫放大技术，可明显提高检测特异性，敏感度可达zepto(10-20)、yocto(10-24)水平，即可实现分子水平的检测。
3.4.1 放射免疫分析技术(RIA)
放射免疫分析法具有特异性强，灵敏度高，准确、快速，操作简便，易于标准化等优点。Ropitar和Zimmer首次报道用于β-肾上腺素能激动剂的放射免疫测定程序和动物组织中CLB的药理学研究。Boyd等应用基质固相分散法与放免法结合对肝脏中CLB残留作了检测，检测中用3H标记克伦特罗，检测限达0.5ng/g，回收率大于70%。目前国外已生产出运用RIA测定CLB的试剂盒产品，还建立了类似放射免疫分析法的放射受体分析法，这种方法是用受体代替抗体结合CLB，检测限可达到2.4ng/g。但是由于放射免疫分析法需要较昂贵的液体闪烁仪或Y-放射仪，且放射性同位素对工作人员有一定的伤害，废弃物又不易处理，这些不利因素限制了该法的广泛应用。
3.4.2 酶免疫分析技术(EIA)
目前，检测CLB较高效的免疫分析技术是ELISA技术。早在1992年，Oriundi就通过ELISA法对尿液和血清中的β-兴奋剂残留进行直接分析，该方法既适于实验室大量样品的检测，也适于屠宰场地少量样品的迅速检测。Sawaya W N等运用ELISA检测了绵羊尿和眼组织中CLB的残留情况，结果最大残留检测限分别为0.272ng/mL和1.5ng/g，但假阳性率较高，检出阳性者需用GC-MS法确证。Degand等建立的直接竞争ELISA，将抗原用辣根过氧化酶(HRP)标记，与抗CLB的单克隆抗体竞争结合，其检测限可达0.05ng/g，最高可达0.003ng/g。目前，英国的Randox Laborato-ries Ltd和德国的r-biopharm公司均开发出了检测肉品、饲料中CLB残留的ELISA试剂盒。中国在应用EIA检测CLB方面的研究起步晚，但近几年取得了明显的进展，目前已有几种试剂盒研制开发成功。叶妮等对中国兽药监察所研制的试剂盒进行了测试，结果表明该试剂盒与德国r-biopharm公司生产的CLB ELISA检测试剂盒有相当的可比性。EIA的优点是灵敏度高、操作简便、检测迅速、价格便宜；缺点是仍不能实现现场检测，而且假阳性率高。
4 CLB检测技术的未来趋势和发展方向
根据目前国内外检测CLB各种方法的进展情况以及CLB滥用及残留的严峻性，建立一种克服上述各种检测方法缺点的简便、快速、准确、可实现现场检测的测定CLB技术势在必行。生物传感器技术(Biosensor，BS) 和滴金免疫技术(DIGFA)是两种快速、高效的残留物分析技术，如能研究、开发运用到检测生物样品中CLB的残留可能会产生理想的效果。
4.1 生物传感器技术(BS)
生物传感器技术是当今世界上备受关注的综合高科技技术之一。所谓生物传感器即由生物活性物质作为敏感元件，即生物识别系统(感受器)，再配上适当的换能器及输出显示装置所构成的分析工具。其原理为分子识别部分与被识别物质相接触，可发生化学变化、热变化、光变化以及直接诱导电信号，而后利用电学测量方法进行检测和控制及显示输出。最早研制成功的是1967年Updike等研制的葡萄糖传感器，它是一种酶传感器。国外已有用生物传感器技术检测CLB残留的资料报道，如PizzarielloAndrea应用分子印迹聚合膜(MIP)作为分子识别系统，选择固相基质复合电极(SBMCE)作为换能器，微分脉冲电压电流表(DPV)作为输出显示装置检测牛肝脏中CLB残留，结果此方法特异性强，与其他同类物质交叉反应低，缺点是反应时间较长，灵敏度还有待于提高。
酶标免疫传感技术是酶标免疫技术与光电分析技术相结合而产生的一种电化学免疫分析技术，是利用生物传感器进行免疫测定的一种实验手段。其特点是利用酶的化学放大作用，通过测定抗原或抗体标记酶作为示踪酶，将酶与底物反应的化学变化用换能器转化为电信号，从而输出待测物质的含量。目前酶免疫传感器的灵敏度最高可达0.01ng/g，而且可在几分钟之内完成检测全过程，比ELISA法更灵敏、更简便和快速，而且可用于各种抗原物质的测定，尤其对体液中的药物和激素的检测更为适用。所以，如果研制成功测定CLB残留的酶免疫传感器，则可使CLB的监测及检测工作变得简单、高效。
4.2 滴金免疫技术(DIGFA)
DIGFA是近年发展起来的一种快速免疫学测定方法，它是胶体金标记技术与快速免疫斑点结合技术相结合的产物。该方法具有与酶联免疫吸附试验(ELISA)相似的特异性和灵敏性，且快速简便，特别是操作无需任何仪器，不经过特殊训练就可得到正确的结果。DIGFA的关键技术是抗CLB单克隆抗体的制备、胶体金的制备、胶体金标记的单克隆抗体的制备、免疫渗滤装置(如硝酸纤维抗体包被膜)的制备。后三种关键技术已比较成熟，最关键的是制备出特异性强、纯度高的抗CLB的单克隆抗体。目前，DIGFA已成功地运用于早孕诊断、弓形虫病诊断、血吸虫病诊断等，灵敏度及准确度均很理想。如果研制成检测CLB的滴金免疫试纸条或滴金免疫测试盒可实现CLB的高效现场检测。所以运用DIGFA技术将是一种较理想、很有发展前景及研究价值的检测CLB技术。
5 结语
上述四种检测CLB的方法中，HPLC、GC-MS、CE的最低检测限都在0.5ng/g以上，而且检测过程烦琐、检测时间长，需贵重仪器、难于操作，不能实现现场检测；EIA法最低检测限可达0.05ng/g，灵敏度和精确度都符合标准，但假阳性率高而且也不能实现现场检测。如果研制成功检测CLB残留的酶免疫传感器和DIGFA试纸条，则可克服上述方法的缺点，并且从定性和定量两个方面实现CLB残留的现场监测。所以，研制高效、方便、迅速的DIGFA试纸条和酶免疫传感器是检测CLB残留的较为理想的方法和途径，值得深入探讨和开发。
（作者：李 洁）
