IBV AH1­99分离株N基因的克隆及序列分析

摘　要：利用RT­PCR技术成功扩增出IBVAH1­99分离株的N基因全长cNDA，将其克隆到pMD18­T载体上。经酶切分析、PCR鉴定及核苷酸序列测定，成功获得该分离株N基因的重组质粒。序列分析结果表明，分离株N基因全长1230个核苷酸，编码409个氨基酸。同部分IBV参考毒株相比，核苷酸同源性为85.8%～89.9%，氨基酸同源性为86.6%～91.0%，在进化关系树中，AH1­99与国内分离株X、LX4亲缘关系较近。

关键词：鸡传染性支气管炎病毒；N基因；克隆；遗传变异分析

鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitisvirus，IBV)是冠状病毒科的代表种。IBV有3种主要结构蛋白，即纤突蛋白(Spirke，S)、膜蛋白(Membrane，M)和核蛋白(Nucleoprotein，N)。其中N蛋白的主要作用是包裹病毒的核酸形成核衣壳，它与病毒的复制有关，同时还是诱导产生交叉反应抗体的主要免疫原，也可刺激产生细胞毒性T细胞反应。

近年来，鸡传染性支气管炎(Infectiousbronchitis，IB)的流行呈上升趋势，世界各地不断分离出变异毒株[1­2]，尤其是肾病变型IB已蔓延到所有养鸡地区，甚至水鸭也可感染肾致病性IBV[3]，给世界养禽业造成了严重的经济损失。我们于2004年分离鉴定了1株肾型IBVAH1­99株(曾命名为NIBV­AH99)[4]并对其S1基因[5]、S2基因[6]和M基因[7]进行了序列测定和遗传变异分析。为了更好地摸清该分离株的遗传变异规律，本研究对其N基因进行了克隆、序列测定和序列分析比较。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　毒株IBV　AH1­99株由安徽农业大学家畜传染病实验室鉴定并保存。

1.1.2　菌株、质粒　E.coil JM83菌株、克隆载体pMD18­T 购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.1.3　参考毒株及其在GenBank中登陆号　Beaudette：M28565；H52：AF352310；M41：M28566；H120：AY028296；D41：AF321275；X：AY043315；TW97­4：AY­363965；DE072：AF203001；GX1­98：AY278110；GX2­98：AY277721；LX4：AY338732；SAIB14：AY167731；SAIB20：AY167730；ZJ971：AF352308。

1.1.4主要试剂　Trizol、鼠源反转录酶、EcoRⅠ酶购自Invitrogen公司；dNTP、TaqDNA聚合酶、T4连接酶、DL 2 000、DL 15000、EB、Rnasin、DTT购自宝生物工程(大连)有限公司；琼脂糖、LB、UNIQ­10柱式DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司；CaCl2、氨苄青霉素、DEPC购自Promega公司；其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2　方法

1.2.1　引物的设计　根据GenBank中已发表的IBV基因序列，利用Premier5.0软件进行设计，该引物包括5a、5b基因在内，扩增片段大小约为1.7kb。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

NP1：5′­ATGAAATGGTTGTCTAGTTTAG­3′

NP2： 5′­TTACAACTCATTCTCTCCAAGT­3′

1.2.2　基因的克隆及鉴定　参照文献[2]进行操作。

1.2.3　序列测定　鉴定为阳性的重组质粒由上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定。

1.2.4　序列分析　利用DNA Star软件，对各基因的核苷酸序列进行分析，构建基因系统发生树，分析其遗传变异。

2　结果

2.1　N基因的RT­PCR

用RT­PCR扩增出IBV AH1­99株包含N基因、5a基因及5b基因全长的cDNA，PCR产物经10g/L的琼脂糖凝胶电泳分析，可见到一条大小约1.7 kb的条带，其大小与设计的相符(图1)。

1.RNA对照； 2.RT­PCR产物； M.DNA标准DL 2 000

1.RNA control；2.Products of RT­PCR；M.DNA Marker DL 2 000

图1　N基因RT­PCR

Fig.1　RT­PCR of N gene

2.2　N基因的克隆与鉴定

N基因(包括5a、5b基因)PCR产物纯化后插入到pMD18­T载体多克隆位点后，构建了重组质粒。用EcoRⅠ对重组质粒进行酶切鉴定，结果得到一条大小约4.4kb的线性片段(图2)，大小与重组质粒相当，证明分离株N基因(包括5a、5b基因)被成功克隆到质粒载体上。

1.重组质粒酶切产物；M.DNA标准 DL 15 000

1.Products of digestion；M.DNA Marker DL 15 000

图2　重组质粒的酶切鉴定/EcoRⅠ

Fig.2　Identification of recombinant plasmids by EcoRⅠ digestion

2.3　N基因的核苷酸序列

N基因全序列共有1230个核苷酸，推导编码409个氨基酸。其中A、G、C、T各碱基所占百分数分别为31.14%、25.93%、20.57%和22.36%；G＋C%含量为46.50%。其核苷酸及其推导的氨基酸序列如图3所示。

2.4　N基因的序列分析

2.4.1　同源性分析　N基因内无碱基的缺失与插入。与参考毒株相比，核苷酸同源性在85.8%～89.9%之间，其中与国内分离株LX4同源性最高，为89.9%。氨基酸同源性为86.6%～91.0%，与国内分离株GX1­98的同源性最高，达到91.0%。其氨基酸的变异主要集中在2aa～15 aa、182 aa～195 aa、227 aa～240 aa、274 aa～278 aa和342 aa～358aa处，即N蛋白的N端，这与以前报道相一致。

2.4.2　N蛋白的一般特性　N蛋白由409个氨基酸组成，分子质量为45.13ku，等电点为9.635，呈碱性。内部有30个丝氨酸(Serine，Ser)，这些Ser明显地成簇，多数位于165 aa～190aa；在228、281、320、322aa有4个半胱氨酸(Cysteine，Cys)。另外，N蛋白内部还一个潜在的糖基化位点(图3)。

2.4.3　N蛋白的亲水性和抗原性　分离株N蛋白大部分由亲水性氨基酸组成，表现出强烈的亲水性。在抗原性上，N蛋白抗原性较强(图4)。

2.4.4　N蛋白磷酸化位点的变化　与标准毒株M41、Beaudette株N蛋白相比，分离株在190位～193位出现了一个新的蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点(SGAE)，在176aa～178 aa出现了一个蛋白激酶C磷酸化位点(SSR)，但缺少参考毒株在97 aa～102 aa(GTGPAA)、262aa～267 aa(GSRITK)位具有的N­豆蔻酰化位点以及在186 aa～189 aa的酰胺化位点(RGRR)。

2.4.5　N基因遗传变异分析　从N基因进化关系树上可以看出，AH1­99与国内分离株LX4、X亲缘关系较近，而与H52、M41、Beaudette等Mass型标准毒株亲缘关系较远，表明分离株可能为变异株(图5)。

图3　N基因核苷酸及其推导的氨基酸序列

Fig.3　Sequence of nucleotide and deduced amino acid of N gene

图4　N蛋白的一些特性

Fig.4　Some characteristics of N protein

图5　IBV N基因进化关系树

Fig.5　Phylogenetic tree of N genes from different IBV strains

3　讨论

虽然N蛋白是IBV主要结构蛋白之一，它的亲水性和抗原性均较强，但是由于它被病毒的囊膜包裹在病毒的内部，因而N蛋白的抗原性较弱。研究表明[8]，在N蛋白上有多个B细胞抗原决定簇，其中3个较强的决定簇分别位于175aa～241 aa、310 aa～370 aa、360 aa～409aa处，而且这3个区域是较为保守的部分。另外，在N蛋白上存在CTL抗原决定簇，其CD8＋T细胞表位在290 aa～409aa处，CD4＋T细胞表位在71 aa～78aa处[9­10]。至于本分离株N蛋白上是否在这些位置上存在这些抗原表位，需要进一步研究。

分离株N蛋白含有4个半胱氨酸，它们的位置分别位于228、281、320、322aa处，这与文献报道的相同。说明半胱氨酸位置与数目与N蛋白的结构和功能有着十分密切的关系，它们的改变可能直接影响到N蛋白的结构和功能。

IBV的N蛋白与病毒的RNA结合形成病毒的核衣壳，它与病毒的复制密切相关。与参考毒株相比，分离株N蛋白磷酸化位点出现了增加和缺失，可能导致N蛋白的空间结构发生变化，影响到N蛋白与病毒核酸的结合，进而影响病毒的复制。

据孟凡磊等报道[11]，国内分离株793/B的N基因第991位碱基缺失。这表明IBV N基因不仅存在碱基的变异，同时存在着碱基的缺失。