摘 要：卵巢玻璃化冷冻是一种操作简单、冷冻效果好的卵巢组织冷冻降温技术，对动物繁殖能力保存、物种保护、生物多样性保存，以及动物胚胎工程和人类临床医学研究与应用等具有重要意义。卵巢组织冷冻保存较卵母细胞冷冻保存，具有明显的优点。在冷冻保护剂的选择、冷冻材料、冷冻平衡及冷冻方法上都有其特殊之处。卵巢组织冷冻保存技术已在人类医学临床上发挥其应用价值。
关键词：冷冻生物学；玻璃化冷冻；卵巢
目前，玻璃化冷冻保存已经广泛地用于保存胚胎与卵母细胞，它作为一种方便，安全，有效的方法，成为未来保存人类及动物生殖能力的一种新方法。玻璃化冷冻保存最早开始于1985年，学者使用玻璃化冷冻保存小鼠胚胎，并认为玻璃化冷冻保存是一种冷冻保存的新方法。随着近年来对于人类生殖能力的保存越来越受到重视，冷冻保存技术已成为人们所关注的一个焦点[1]。2003年，美国受癌症折磨的妇女超过65000人，其中相当一部分人处于生育年龄[2]。对于青少年患者来说，冻存植入前胚胎几乎是不可能的；冻存成熟和未成熟卵母细胞也有许多技术上的难题，而并不能保证生育；卵巢组织的冻存与移植是将来解决癌始前妇女症患者生育能力保存最有希望的方法[2]。
利用简捷有效的玻璃化冷冻保存技术，可以对突然死亡的珍稀物种或稀有突变体动物的卵巢予以及时的冻存，并在解冻后通过移植体外受精等技术获得该物种。卵巢组织冷冻保存技术在保持生物多样性，以及对胚胎工程学及生殖生物学的研究有着重要的意义。
1 卵巢玻璃化冷冻的优缺点
在冷冻保存卵巢组织的研究中，应用最多的冷冻方法是慢速冷冻法，程序化冻存法是采用冷冻仪按设置的程序进行冷冻效果稳定。但如果没有购置冷冻仪便无法操作更不可能在户外操作，这对于动物种质资源的保护不利，而且冷冻过程花费的时间长，需要耗费大量的液氮，使用不方便，利用的价值也不高。而玻璃化冷冻技术作为一项操作简单、冷冻效率高的冷冻降温技术在该研究领域内应用日渐受到重视。玻璃化冷冻技术应用适当高浓度的冷冻保护剂(cryoprotectiveagent，CPA)结合极快的制冷速度，使细胞内液体形成玻璃化状态以避免细胞内外冰晶的形成。此方法的优点是无需特殊冷冻仪器，冷冻过程时间短，细胞内冰晶形成少，机械性损伤少。但由于玻璃化冷冻需高浓度的CPA，其细胞毒性和渗透性损伤较大，对卵巢组织有一定的损伤作用[3]。卵巢组织冷冻复苏后初级卵泡的正常形态率明显低于原始卵泡，说明冷冻复温对初级卵泡的损伤大于原始卵泡，可能与初级卵泡较原始卵泡代谢率高，对冷冻降温敏感的颗粒细胞增多、增大，冻存时易发生冷冻损伤有关[4]。
2 卵巢玻璃化冷冻程序
2.1 冷冻保护剂
卵巢组织常用的冷冻保护剂为甘油(glycerol)、二甲基亚砜(DMSO)、乙二醇(EG)和丙二醇(PROH)等。选择毒性小的冷冻保护剂效果会更好，考虑到PROH冻存的卵巢组织解冻后发育优于DMSO[5]及DMSO常温时的毒性作用，主张采用超快速冻存法(ultrarapid freezing， URF)时使用丙二醇和蔗糖做冷冻液为宜。LIYu-bin等[6]收集了15例病人的卵巢组织采用联合使用DMSO和PROH玻璃化冷冻保存，发现新鲜卵巢组织中原始卵泡为97.6%，明显高于玻璃化冷冻的80.3%和慢速冷冻保存的72.6%，而玻璃化冷冻保存则高于慢速冷冻保存。IsachenkoV等[7]提出卵巢组织的冷冻与精子、卵母细胞和胚胎的冷冻不同，只需要使用一种渗透性的冷冻保护剂阻止冰晶的形成，他们提出的玻璃化冷冻配方是甘油或EG＋卵黄＋supercoolx-100。Rahimi G等[8]采用甘油＋乙二醇＋SupercoolX-100作为玻璃化液冷冻保存的人类卵巢组织，将冻融的人卵巢组织移入免疫缺陷小鼠皮下6周后与对照组相比，组织学检查证实移植物中坏死细胞的数量、坏死组织的面积无显著增加，与采用慢速程序冷冻法的对照组均无统计学差异。说明玻璃化冷冻法可替代传统的慢速冷冻法，不同冷冻保护剂的联合使用能够使卵巢组织和卵母细胞的存活率都有相应的提高。
2.2 平衡温度及时间
Vajta G等[9]在1997年首次报道先将猪胚胎在39℃的恒温板中平衡3 min后移入玻璃化冷冻保护剂30s后投入液氮罐。也有学者比较了不同预处理温度对卵巢组织冷冻保存的影响，在4 ℃和37 ℃同时预先处理冷冻保存的卵巢组织，发现4℃处理的卵巢组织，解冻后原始卵泡存活率明显高于在37 ℃和没有经过处理的卵巢[10]。 BabaeiH等[11]将卵巢组织放置到平衡液(10%乙二醇和10%DMSO)中15min，再将卵巢组织在室温下放置冷冻保护液(20%乙二醇和20% DMSO)中2min，取得了很好的效果。说明卵巢组织在平衡剂中先放置一定时间能有效的减少高浓度的冷冻保护剂对组织细胞的损伤。
2.3 卵巢组织大小
玻璃化冷冻保存导盲狗卵巢组织，将卵巢组织切成1 mm×1 mm×1 mm、3 mm×3 mm×3 mm和5 mm×5 mm×5mm，从形态学上观察1 mm3～125 mm3的冻存组织块时，发现卵巢损伤没有差异[12]。说明卵巢组织大小在125mm3左右时，冷冻保护剂也能够渗透到组织内，冷冻时阻止组织冰晶化从而保护卵巢组织中的原始卵泡。在卵巢组织冷冻时，也可以采用活检或手术切除取得卵巢皮质组织后切分分离，每个卵巢皮质组织块的体积大约为0.5mm3～5mm3，而且要尽量除去卵巢髓质部分，并要保证所取的皮质组织无肉眼可见的黄体和卵泡，因为卵巢髓质部分可能存在抑制卵泡生长的因子。IsachenkoV等[7]获取的是牛的卵巢上皮组织，每个组织块为2 mm3。
2.4 卵巢玻玻化冷冻保存方法
玻璃化冷冻保存方法的关键是让卵巢组织使用高浓度的冷冻保护剂经快速降温后，由液态直接转化为非晶体玻璃化状态，最大限度地减少细胞内冰晶的形成，降低对细胞的损伤。IsachenkoV等[7]将卵巢组织小块装入0.25 mL麦管内冷冻保存，结果表明，仅用渗透性冷冻保护剂比混合应用蔗糖的效果好。FalconeT等[13]提出采用一个特殊的泵，通过卵巢的血管将冷冻保护剂灌注入卵巢中，认为通过此方法冷冻保护剂可以完全渗透卵巢组织。说明不管使用那种冷冻保存方法，只要冷冻保护剂能够完全渗透卵巢组织，且又能减少组织细胞损伤的方法，是学者一直在追求的目标。
3 卵巢组织冻存的应用
在医学临床方面，2005年报道一位28岁以色列妇女因治疗霍奇金病而导致不孕，通过冷冻保存卵巢组织后进行自体移植而成功妊娠产子[14]。DemeestereI等[15]采用冷冻保存卵巢组织自体原位和异位移植相结合的方法治疗霍奇金病而闭经的患者。卵巢组移植后，恢复正常月经周期，自然妊娠，但最后流产。OktayK等[16]报道了将冻存卵巢自体移植到患者前臂皮下(1例35岁Ⅲ b期宫颈鳞癌患者，1例37岁复发性肿瘤良性囊肿者)，术后E2上升，FSH和LH下降，B超监测每个月均有1个优势卵泡发育，宫颈癌患者还从皮下移植物中抽吸出1个成熟卵子。在新鲜冻融新生小鼠卵巢移植研究中发现，新鲜卵巢移植体卵泡数为同龄未移植卵巢的58%，冻融卵巢移植体卵泡数只比新鲜卵巢移植体少9%，表明新生小鼠卵巢移植后早期原始卵泡的丧失主要是由于移植本身而不是由于冷冻保存引起[17]。许培箴等[18]将20周龄～24周龄胎儿卵巢组织冷冻保存，解冻后移植3例卵巢性闭经患者。2例有自体卵巢患者有周期性月经出现。其中l例术后第4个月可观察到规则排卵，另1例双侧卵巢切除患者潮热症状改善，雌激素水平上升，但不能达到生育年龄正常水平，月经周期未能恢复。说明胎儿卵巢组织移植可有效地治疗卵巢内分泌功能不足。
早期卵巢功能的丧失不但使患者在很年轻时承受更年期并发症的风险，而且可能丧失生育能力，保存生育能力成为许多患者的愿望[19]。而对于已婚已育的女性，为了保存其卵巢功能，可以取出一侧卵巢进行冷冻，在其围绝经期再将该侧卵巢复苏并重新植入体内。这种方法可以推迟女性绝经期的到来，从而提高中老年女性的生活质量。综上所述，玻璃化冷冻保存卵巢组织可能是一种保护遗传资源的有效方法，具有较高的可行性和可操作性，该技术的发展为物种遗传资源的保护带来了乐观的前景。