摘 要：为建立一种快速检测猪表皮生长因子(pEGF)活性的方法，用本实验室构建的pEGF酵母表达载体进行摇瓶培养，通过鉴定为所需要的目的蛋白，用pEGF为添加物培养Balbc/3T3细胞，以pEGF浓度为横坐标，吸光度为纵坐标建立曲线。结果表明，理想的接种细胞的个数为5000个/孔，细胞计数试剂盒(CCK-8)孵育的最佳时间为1.5 h， pEGF和人表皮生长因子(hEGF)标准品，在1ng/mL～100ng/mL范围内对细胞的增值作用相当，表明pEGF和hEGF有相同的生物学活性。建立了用CCK-8快速测定pEGF活性的方法。
关键词：猪表皮生长因子；生物活性；体外CCK-8
猪表皮生长因子(porcine epidermal growth factor，pEGF)是含有53个氨基酸的单链多肽，分子质量为6ku，它作为一种丝裂原，能刺激培养细胞的分裂增殖，同时也能促进表皮细胞及其他组织的生长与分化。研究表明pEGF在猪生殖系统中广泛存在，可能参与子宫、输卵管和卵巢的功能调节，从而影响受精过程，对母猪的受孕、妊娠过程起到重要的调节作用。按照国家2005年药典的规定，将用基因工程菌生产的pEGF添加到DMEM培养基中，培养Balbc/3T3细胞，再用细胞计数试剂盒(cellcounting kit-8，CCK-8)测定细胞活性，结果表明细胞增殖效果显著。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器
细胞株为Balbc/3T3细胞(小鼠的成纤维细胞，购自中科院上海细胞所)；含pEGF基因的表达载体GS115酵母菌种(本实验室构建)；DMEM基础培养基(GBICO公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；青链霉素(GBICO公司)；谷胺酰胺(华美生物工程公司)；低分子量蛋白标准(Invitroden公司)；国际标准的hEGF(humanepidermal growthfactor，hEGF)(Invitrogen公司)；待测的pEGF，CCK-8(同仁化学研究所)；ELX800型酶标仪(美国Bio-Teck公司)；CO2细胞培养箱(美国Shellab公司)；25mL细胞培养瓶，96孔细胞培养板等(Corning公司)；核酸-蛋白测定仪(Eppendorf Biophotometer)。
1.2 方法
1.2.1 不同浓度hEGF和pEGF的配制 用核酸-蛋白测定仪分别测定hEGF和pEGF的浓度，然后用DMEM基础培养基把两者均稀释成1、10、100、1μg/mL的浓度梯度。
1.2.2 Balbc/3T3细胞的培养 扩大培养Balbc/3T3细胞，等到混合度达到80%以上时，传代到96孔板。
1.2.3 细胞生长标准曲线的制作 按照以下密度梯度接种Balbc/3T3细胞到96孔板，1 000、2 000、3 000、4000、5 000、6 000、8 000、10 000、20 000个/孔，培养4h后，吸走培养基，每孔加入含10%的CCK-8的基础培养基100 μL，孵育分别在1、1.5 、2h时，测OD450值，以细胞数为横坐标，吸光度为纵坐标，作出细胞标准曲线，确定CCK-8的最佳孵育时间。
1.2.4 细胞生长曲线制作 Balbc/3T3细胞，按照每孔5000个细胞/孔接种6块96孔板，分别培养6、12、24、36、48、60 h后，换成含10%的CCK-8基础培养基，继续孵育1.5h，测定吸光度，确定细胞的生长曲线。
1.2.5 活性测定 按照每孔5 000个细胞/孔接种于96孔板，完全培养基培养24 h后，用DMEM基础培养基饥饿培养12h，加入1.2.1中浓度梯度的样品pEGF和标准品hEGF(阳性对照)的培养基。同时用基础培养基作空白对照。培养48h，用10%的CCK-8基础培养基孵育1.5h，测定OD450值。每个浓度作5个重复，用t检验分析不同浓度的pEGF的细胞生长与阳性对照以及空白对照差异显著性。
2 结果
2.1 Balbc/3T3细胞生长标准曲线
以1 000、2 000、3 000、4 000、5 000、6 000、8 000、10 000、20000个细胞/孔，接种于96孔板，培养4 h后，用含CCK-8试剂的培养基孵育1.5h，测定OD450。以OD450值为纵坐标，细胞数目为横坐标，作细胞生长标准曲线，并计算线性方程。结果见图1。由图1可知，用CCK-8试剂孵育Balbc/3T3细胞1.5h，细胞数在1 000个～20 000个范围内，细胞数目与吸光度的相关性非常好(r＝0.9944)，且吸光度梯度明显。根据标准曲线可以很容易的找出不同的吸光度所对应的细胞数。从而可以判断pEGF在某个浓度对细胞增殖最明显以及增殖的程度。
图1 Balbc/3T3细胞标准生长曲线
Fig.1 The standard growth curve of Balbc/3T3 cell
2.2 Balbc/3T3细胞的生长曲线
以每孔5 000个细胞接种96孔板，用完全培养基分别培养6、12、24、36、48、60h，用含10%的CCK-8基础培养基孵育1.5h，测定OD450，以吸光度为纵坐标，培养时间为横坐标，其细胞生长曲线见图2。由图2可以看出，5 000个细胞/孔接种96孔板，在6h～12 h内细胞几乎没有增加，培养24 h后，细胞增殖1倍，培养48 h后，细胞增殖4倍。
图2 细胞生长曲线
Fig.2 The growth curve ofBALBc/3T3cell
2.3 pEGF的生物活性
以每孔5 000个细胞接种96孔板，用完全培养基培养24 h，饥饿培养12 h，用不同浓度的pEGF和hEGF培养细胞48h后，用含CCK-8的培养基孵育1.5 h，测定OD450值，以吸光度为纵坐标，EGF浓度为横坐标作图3。由图3可知，浓度＜100ng/mL的hEGF和pEGF对细胞有良好的增殖作用。其中100ng/mL的pEGF对Balbc/3T3细胞增殖作用最明显。pEGF及hEGF各浓度的OD450值与空白组比较差异显著(P＜0.01)，pEGF和hEGF在相应浓度的OD450值差异不显著(P＞0.05)。
图3 不同浓度的标准品hEGF和pEGF对Balbc/3T3细胞活性影响
Fig.3 The effect of standard hEGF and pEGF with differentconcentration on Balbc/3T3 cytoactivity
3 讨论
本试验用酵母表达的重组猪表皮生长因子是由N-端不同的两条肽链组成，一条肽链与天然的pEGF相同，另一条的的N端来源于信号肽的两个氨基酸残基，另外在重组猪表皮生长因子的C端具有6个his标记。因重组的猪表皮生长因子是否具有生物学活性是其应用于临床的前提条件。表皮生长因子是一种强有丝分裂原，有促进多种组织细胞的生物学效应。Balbc/3T3细胞是一种建株的鼠胚胎性成纤维细胞，农业部规定采用Balbc/3T3细胞来衡量pEGF的生物学活性。所以本试验采用该细胞株检测重组猪表皮生长因子的活性。
本试验没有采用传统的MTT法测细胞的活性，因为MTT产生的甲臜不是水溶性的，需DMSO来溶解，后续工作多，产物不稳定，有机溶剂还会导致蛋白质沉淀而影响测定结果，而CCK-8试剂盒，产生高度水溶性的甲臜，使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；检测快速；灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度；重复性优于MTT；对细胞毒性小。由于随着CCK-8孵育时间的延长，形成的黄色甲赞燃料增加，吸光度也增加，故有必要优化pEGF与CCK-8的孵育时间。本试验通过比较不同数目的细胞与WST-8孵育1、1.5、2h的吸光度大小，发现cck-8试剂与Balbc/3T3细胞孵育1 h，细胞数目与吸光度的相关系数不高；孵育2h，吸光度超过2.0。故检测pEGF生物学活性时，确定CCK-8试剂与Balbc/3T3细胞的孵育时间为1.5 h。
pEGF促进细胞增殖需要一定的培养时间，培养的时间取决于细胞生长的快慢。本试验得到的Balbc/3T3细胞的生长曲线表明，pEGF作用细胞48h，细胞数目增加了4倍，故确定pEGF作用48h。此外，细胞生长，除了必要的营养外，其自身也会分泌有利于其增殖的生长因子，不同密度的细胞接种量，分泌的生长因子不同，因此，制定一个合适的接种量很重要。本试验通过测定，最终确定每孔5000个细胞/孔接种量最合适。
细胞体外培养都要添加一定比例的胎牛血清，血清不仅提供细胞生长所需的营养成分，而且还含有多种活性物质能促进细胞的增殖。为避免此因素对pEGF增殖作用的干扰，试验将细胞接种培养24h后，进行12h的饥饿培养，消耗这些干扰因子，然后再重新加入含pEGF的、不含血清和双抗的DMEM培养基来鉴定pEGF对细胞的增殖作用。
试验用CCK-8试剂测定pEGF对细胞的生物活性作用，结果表明，浓度为1 ng/mL～100ng/mL的重组pEGF能显著促进Balbc/3T3细胞增殖，且增殖效果与同样浓度梯度的hEGF标准品相当，表明本实验室构建的基因工程菌表达纯化的重组pEGF具有较高的生物学活性。