摘 要：以3株国内分离的O型口蹄疫病毒(FMDV)(分别命名F1、F2、F3)为研究目标，根据GenBank中注册的FMDVVP1基因的序列设计2对引物，采用RT-PCR方法成功地扩增出含有VP1全基因的cDNA片段，将3个cDNA片段分别克隆到pMD20-TVector载体中进行序列测定，得到3个毒株VP1基因的序列。结果表明，3个O型FMDV毒株VP1基因cDNA长度均为639bp，编码213个氨基酸。3株O型毒株彼此之间的核苷酸序列同源性在92.3%～94.2%之间，推导氨基酸序列同源性在97.2%～98.6%之间。与3个毒株同源性高的主要为香港和台湾的毒株。
关键词：口蹄疫病毒；VP1基因；序列分析
口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth diseasevirus，FMDV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。世界各国都高度重视FMD疫情，世界动物卫生组织(OIE)和世界粮农组织(FAO)将其列为必须报告的动物传染病之首。近年来，FMD的流行和分布发生了明显的变化，世界上大多数国家和地区仍然有FMD的流行，亚洲和非洲FMD长期泛滥，欧洲、北美和大洋洲没有，南美呈散发式流行[1]。2006年，南非，越南，荷兰，我国的西藏及新疆地区也相继暴发口蹄疫[2]。
FMD的不断暴发，不仅给流行国家或地区的畜牧业造成巨大的经济损失，而且严重地干扰了这些国家或地区的社会经济秩序，并导致政治危机和国际间贸易摩擦。FMDV含单股正链RNA和衣壳蛋白两部分，无囊膜。衣壳由4种结构蛋白VP1、VP2、VP3、VP4组成，其中VP1是诱导中和抗体的主要成分，其核苷酸易发生变异，具有重要的抗原位点，是FMDV抗原变异的关键所在[3]。在分子流行病学调查中，趋向于通过比较分析VP1基因的核苷酸序列差异来建立遗传系谱树[4]。对VP1基因核苷酸序列的测定还可以揭示核酸和主要抗原位点肽链的组成，为合成主要抗原表位基因、研制基因工程疫苗奠定基础。本研究中对3株O型FMDV流行株VP1基因进行了克隆和序列测定，旨在为口蹄疫的分子流行病学研究提供依据。同时进一步丰富我国FMDV毒株VP1基因资料库，为更加科学地防控FMD提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病毒 3株O型口蹄疫病毒，分别命名为F1、F2、F3，本实验室收集保存。
1.1.2 酶类及其他试剂 AMV反转录酶，HRP RNA抑制剂，Ex Taq DNA聚合酶，dNTPs，DNA Marker DL2000均为TaKaRa产品；DEPC，饱和酚购自上海生工生物工程公司；琼脂糖购自基因公司；溴化乙锭(EB)购自宝泰克生物科技有限公司；RNA提取试剂盒TRIzol Reagent为GibcoBRL公司产品；Plasmid Minipreps Kit和GelExtraction Kit 均为Omega产品。
1.2 方法
1.2.1 引物设计与合成 应用DNA Star软件，参照GenBank中注册的O型FMDVVP1基因序列，设计1对通用引物1C(5′-GACCACAAAYGTYCAGGGATG-3′)/2B(5′-AGCTTGTACCAGGGTTTGGC-3′)，用于扩增3个毒株的VP1基因，引物1C/2B理论跨幅为1030 bp，包含整个VP1基因序列。引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。
1.2.2 VP1基因的RT-PCR 按GibcoBRL公司Trizol LS ReagentRNA提取试剂盒的使用说明书进行FMDV RNA的提取，以1C/2B为引物进行RT-PCR扩增VP1基因cDNA。
1.2.3 VP1基因cDNA的克隆与鉴定 将VP1基因cDNA产物回收纯化后与pMD20-T进行连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆，用PlasmidMiniprepsKit提取质粒，进行用EcoRⅠ酶切鉴定。然后送上海生工生物工程技术有限公司和上海博亚生物工程技术有限公司进行序列测定。
1.2.4 VP1基因核苷酸序列及其推导氨基酸序列的比较分析 对所测定的序列进行整理，确定核苷酸顺序后，采用NCBI的BLAST程序，对所测的3个毒株的核苷酸序列及推导的氨基酸序列与GenBank中注册的序列进行比较，分析它们之间的同源性、变异程度。
1.2.5 VP1基因核苷酸序列及其推导氨基酸序列的系统进化关系分析 从GenBank中选择不同年代、不同地区分离的O型FMDVVP1基因序列，利
用DNAstar软件对这些序列的核苷酸序列系统进化关系、氨基酸序列系统进化关系进行分析。
2 结果
2.1 VP1基因的RT-PCR
用所设计的通用引物2B/1C进行RT-PCR，从3个毒株中均能扩增到包含VP1全长的cDNA，大小约为1 000bp左右，与预期的相吻合(图1)。
M.DNA标准 DL 2 000；1.阴性对照；2.F1 VP1基因；3.F2 VP1基因；4.F3 VP1基因；
M.DNA Marker DL 2 000；1.Negative control；2.F1 VP1 gene；3.F2 VP1gene；4.F3 VP1 gene
图1 3株FMDV VP1基因的RT-PCR扩增结果
Fig.1 Results of VP1 genes of 3 FMDV strains amplified by RT-PCR
2.2 VP1基因cDNA的克隆及鉴定
3个VP1全长cDNA的RT-PCR产物经纯化后，插入pMD20-T载体的外源基因插入位点，分别构成重组质粒F1-T，F2-T和F3-T。挑取转化DH5ɑ后的单菌落进行培养，直接以培养的菌液为模板进行PCR鉴定，扩增到一条长约1000 bp左右的片段。从PCR阳性的菌落中提取质粒后用EcoRⅠ进行酶切鉴定，酶切后的重组质粒可产生两条带，一条为载体质粒，大小约3000 bp，另一条为插入的外源片段，大小约1 000bp。结果表明3个毒株的VP1基因全长cDNA已成功地克隆到载体质粒pMD20-T载体中(图2和图3)。
M.DNA标准 DL 2 000；2,5.阴性质粒；1,3,4,6～8.阳性质粒
M.DNA Marker DL 2 000；2,5.Negative plasmids；1,3,4,6-8.Positiveplasmids
图2 重组质粒的PCR鉴定
Fig.2 Identification of recombinant plasmid by PCR
M1.1 000 bp DNA ladder plus；M2.DNA标准 DL 2000；1,3,5分别为F1-T、F2-T、F3-T的EcoRⅠ酶切产物；2,4,6分别为F1-T、F2-T、F3-T
M1.1 000 bp DNA ladder plus；M2：DNA Marker DL 2 000；1,3,5.EcoRⅠenzyme-digested products of F1-T，F2-T，F3-T；2,4,6.F1-T，F2-T，F3-T
图3 重组质粒的酶切鉴定
Fig.3 Identification of recombinant plasmid by restriction enzymedigestion
2.3 VP1基因的序列测定
对经过PCR鉴定的重组质粒进行序列测定，结果表明，3个O型毒株的VP1基因全长均为639bp，编码213个氨基酸(图4)。将所测定的3个
毒株的全长VP1基因序列通过NCBIBLAST程序与GenBank中注册的核苷酸序列进行比较，结果表明与这3个O型毒株同源性最高的50个序列均为O型FMDVVP1基因序列，这进一步证明上述所测定的3个毒株的核苷酸序列均为相对应型的FMDV VP1基因序列。
2.4 VP1基因核苷酸序列和推导氨基酸序列的比较
利用DNAStar软件对本试验测得的3个毒株进行比较，发现3个O型毒株彼此之间的核苷酸序列同源性在92.3%～94.2%之间(表1)，氨基酸序列同源性在97.2%～98.6%之间(表2)。与本试验室在2002年所测定的几个毒株L1、L2、L3、L4、L5的核苷酸序列同源性在82.8%～97.2%之间，氨基酸序列同源性在87.8%～99.5%之间[5]。
通过NCBIBLAST进行在线分析，发现与本试验测得的核苷酸序列同源性最高的30个序列大部分是香港和台湾地区分离的毒株，其中与F1、F2、F3同源性最高的序列依次为DQ164887、DQ164888、DQ164884、DQ164881、DQ164881、AY317098、DQ164889(均为O型，名称分别为基因注册号)，在这些毒株之间未发现核苷酸的缺失或插入。
图4 3株 FMDV VP1基因推导氨基酸序
Fig.4 The deduced amino acid sequence of VP1 genes from 3 FMDVstrains
表1 不同毒株VP1基因核苷酸序列差异分析
Table 1 The homological nucleotide sequences of VP1 gene fromdifferent FMDV strains
表2 不同毒株VP1基因推导氨基酸序列差异分析
Table 2 The homological deduced amino acid sequences of VP1 genefrom different FMDV strains
2.5 VP1基因核苷酸序列和推导氨基酸序列的系统进化关系
从核苷酸序列及推导氨基酸序列的系统进化树上可看出F1、F2在同一分支上。F3与中国台湾毒株Chunhwa-158在一分支上。F1、F2、F3与2000年所测毒株L1、L3、L4、L5距离稍近，但不在同一分支；与L2的距离较远(图5和图6)。
图5 VP1基因核苷酸序列系统进化分析
Fig.5 Phylogenetic tree based on nucleotide sequences of the VP1gene
图6 VP1基因推导氨基酸序列系统进化分析
Fig.6 Phylogenetic tree based on deduced amino acid sequences ofVP1 gene
3 讨论
FMDV的毒力和抗原性都易发生变异，经过不断的抗原“漂移”过程，导致一系列亚型乃至型的产生[6]。FMDVVP1基因的核苷酸序列是一个高度可变区。分析这个高变区不仅对FMDV遗传变异的研究有指导意义，而且对FMD的流行病学研究、疫源的追踪、毒株型和亚型的分析，为合理的选择疫苗，甚至为诊断抗原的制备及新型疫苗的研制提供理论指导[7-8]。
VP1的140位～160位和200位～213位氨基酸集中了O型FMDV重要表位，是病毒抗原变异的关键所在，144、148、154位和208位氨基酸是关键氨基酸，这些氨基酸的改变会程度不同地影响抗原位点与相应单克隆抗体的反应性[9]。从本试验的结果来看，2006年的毒株(F1，F2，F3)与2000年的毒株(L1，L2，L3，L4，L5)其VP1序列已经有了些变异，其中F1VP1基因的158位氨基酸由T→A，F2的VP1基因的153位氨基酸由Q→K、158位氨基酸由T→A。不过3株毒株的VP1基因序列144(V),148(L),154(K)和208(P)位等关键氨基酸均未发生变化。另外，3毒株的44位关键氨基酸(P)也未发生变化。据报道，O1K株的VP1基因的134位氨基酸是半胱氨酸(C)，其与VP2基因的130位半胱氨酸以二硫键相连，体现在抗原表位上是立体构象依赖性的，在液相ELISA中单抗与之最大限度地反应[10]，而A型病毒VP1基因的130位～160位氨基酸残基中没有半胱氨酸，不形成二硫键，单抗既可在液相又可在固相ELISA中与之最大限度地反应。本试验中，3株毒株VP1基因的134位氨基酸发生了改变，由半胱氨酸(C)→丝氨酸(S)，不同于O1K株，而与其他A型FMDV一致。
据报道，VP1的145位～147位氨基酸由精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)组成，该区段参与构成病毒的细胞吸附位点，所有血清型毒株的该区段的氨基酸保守，以保持病毒对细胞的侵染性[11]。在本试验中，3株毒株都符合这一规律，存在RGD组成的病毒受体位点。