摘 要：为建立定量测定鸡食用组织中喹烯酮的高效液相色谱检测方法，并依据测定的结果制定最高残留限量，确定其休药期。选用63只鸡，按正常饲料添加喹烯酮(75mg/kg)饲喂2.5月后，按既定时间点采样。组织样品用乙酸乙酯等试剂提取处理纯化后进样，在312nm波长处检测，流动相为甲醇-水(70∶30)，流速为1.0 mL/min。结果表明，在试验条件下，脂肪、肝脏、肾脏、肌肉组织中的最低检出浓度均为0.005μg/g。平均回收率肌肉为99.23%±2.75%，脂肪为105.15%±8.65%；肝脏为93.55%±11.16%；肾脏为104.10%±9.80%。喹烯酮在肌肉皮脂中1d后均无残留，而在肝脏和肾脏中的残留量也很小，2d以后再无残留。精密度考察喹烯酮的日内和日间各组织各浓度的相对标准差均小于8.5%。因此，本试验测定方法灵敏度高，重复性好。停药后4h所有可食用鸡组织中喹烯酮浓度均低于计算所得的安全组织浓度，故该药在鸡上使用无休药期，即休药期为0 d。
关键词：喹烯酮；高效液相色谱；残留；休药期；食用组织；鸡
喹烯酮(Quinocetone)是一种新型药物饲料添加剂，属于喹恶啉类-1.4-二氧化物的衍生物，具有与喹乙醇同样的防病和促生长作用[1-2]，同时药效与毒性及体内代谢情况完全不同于喹乙醇和肉加多[3-5]。十几年来，喹烯酮已在国内10余省市的一些饲养场和农户中试用，其防病促生长效果良好且安全无毒副作用。按我国农业部制定的兽药残留试验技术规范的要求，建立了定量测定鸡肝脏、肾脏、肌肉、脂肪食用组织中喹烯酮的高效液相色谱检测方法，并依据测定的结果制定了最高残留限量。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
Waters 510高效液相色谱仪，Waters510型输液泵，480型可调波长紫外检测器，U6K型进样阀，AST型数据处理仪，3800型打印机。
喹烯酮标准品，中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所化学药物合成室合成，纯度为99.9%。甲醇为色谱纯，重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 色谱条件 紫外检测波长312 nm；色谱柱Prodigy 5 μm Phenyl-3 (4.6 mm×250 mm 5μm)；流动相为甲醇-水(70∶30)；流速1.0 mL/min；灵敏度0.02 Aufs；柱温30 ℃；进样量20 μL。
1.2.2 溶液配制 精密称取喹烯酮25.0 mg，置于50 mL容量瓶内以甲醇溶解，并定容成500.0μg/mL的喹烯酮标准液；取该标准液1.0 mL于50 mL容量瓶内，以甲醇溶解并定容至50 mL，得10.0μg/mL喹烯酮标准液，置冰箱中保存备用。
1.2.3 实验动物 15日龄健康石歧杂肉鸡63只(公32，母31)，按正常饲料添加喹烯酮(75mg/kg)饲喂2.5月后，分别于停药后4 h和1、2、3、4、6、8、12、15d处死鸡，取肝脏、肾脏、肌肉、皮脂组织样品，置于－20 ℃冰箱冷冻保存。
1.2.4 样品制备 准确称取组织样品5.0 g，匀浆(以研钵研磨)，加10 mL双蒸水，漩涡振荡1 min，加乙酸乙酯15mL，漩涡振荡1 min,3 000 r/min离心5 min，分离乙酸乙酯，再分别以8,5mL乙酸乙酯依次同法提取，合并乙酸乙酯提取液。氮气吹干乙酸乙酯，残渣以氯仿2 mL分两次溶解并转入10 mL的离心管中。向离心管中加2mL双蒸水，漩涡振荡1 min,3 000 r/min离心5 min，分取氯仿层。氮气吹干氯仿，残渣以乙腈2mL分两次提取，合并乙腈提取液。乙腈液以2 mL正己烷提取两次，弃正己烷液。向乙腈液加2 mL双蒸水，振荡1 min，用2mL正己烷提取2次，弃正己烷液。再向乙腈水液中加氯仿1 mL，漩涡振荡1 min，分取下层有机相。氮气吹干有机溶剂，残渣以流动相0.2mL溶解，用离心过滤管过滤，取下清液20 μL，注入色谱柱。
1.2.5 标准曲线的绘制 分别配制含喹烯酮0.000、0.002、0.005、0.008、0.010、0.020、0.050、0.080μg/g的组织样品，依照制样方法操作。所得的结果以喹烯酮峰高为横坐标，以喹烯酮的浓度为纵坐标，进行回归计算得回归方程。
1.2.6 残留最低检出浓度 制备含不同浓度的喹烯酮组织样品，依照制样方法操作，将可出现药物峰的组织浓度定为最低检出浓度。
2 结果
2.1 色谱条件的优化
流动相甲醇和水的比例、样品处理过程中的各个试剂量的多少和先后顺序以及流速柱温等进行了优化，确定了试验的色谱条件。该条件下，喹烯酮的保留时间为10.6min～11.2 min，色谱峰形较好。
2.2 线性范围和检测灵敏度
依据标准曲线的绘制的方法，得曲线方程：脂肪，Y＝4×10－5X－0.029 3，r＝0.994 4(n＝5)，Y的线性范围0.005μg/g～0.080 μg/g；肝脏，Y＝3×10－5X－0.02，r＝0.992 6(n＝8)，Y的线性范围0.005μg/g～0.500 μg/g；肾脏，Y＝4×10－4X－0.039 4，r＝0.993 3(n＝10)，Y的线性范围0.005μg/g～0.800 μg/g；肌肉，Y＝6×10－5X－0.063 1，r＝0.992 6(n＝6)，Y的线性范围0.005μg/g～0.080 μg/g。
试验条件下，组织中的最低检出浓度，脂肪、肝脏、肾脏、肌肉均为0.005 μg/g。
2.3 精密度试验
分别配制含喹烯酮0.008、0.020、0.080μg/g的标准组织样品，每个浓度5个样品，依照制样方法操作，每个样品重复进样5次，分别测量日内及日间精密度，结果日内各组织各浓度的RSD(相对标准差)均小于5.1%，日间测得各组织各浓度的RSD均小于8.5%。
2.4 回收率测定
分别配制含喹烯酮0.008,0.020 μg/g和0.080μg/g的组织样品，每个浓度5个样品，依照制样方法操作，每个样品重复进样5次，将所得的峰高值代入回归方程求得的浓度与实际浓度相比得回收率。结果三个浓度的平均值为肌肉(99.23±2.75)%，脂肪(105.15±8.65)%，肝脏(93.55±11.16)%，肾脏(104.10±9.80)%。
2.5 个体动物可食用组织中所含喹烯酮的浓度
以75 mg/kg饲料添加喹烯酮饲喂15日龄的健康石歧杂肉鸡63只(公母各半)， 2.5月后，分别于停药后4h和1、2、3、4、6、8、12、15 d取肝脏、肾脏、肌肉、皮脂组织样品，各时间点处死鸡的组织药物浓度见表1。停药3 d～15d的鸡各组织药物残留为0。
表1 饲喂后2.5月个体动物可食用组织中所含喹烯酮的水平
Table 1 Quinocetone concentration in chicken edible tissue afterquinocetone was given continuously for 2.5 months
停药时间 Withdrawal time | 动物编号 Serial No. of animal | 喹烯酮的平均浓度/(μg·g－1) Average concentration of quinocetone | |||
肝 Liver | 肾 Kidney | 皮脂 Sebum | 肌肉 Muscle | ||
4/h | Kc4h1 | 0.000 0 | 0.000 0 | 0.000 0 | 0.000 0 |
4/h | Kc4h2 | 0.000 0 | 0.000 0 | 0.000 0 | 0.000 0 |
4/h | Kc4h3 | 0.000 0 | 0.040 0 | 0.020 0 | 0.000 0 |
4/h | Kc4h4 | 0.005 0 | 0.000 0 | 0.000 0 | 0.000 0 |
4/h | Kc4h5 | 0.013 0 | 0.150 0 | 0.000 0 | 0.000 0 |
4/h | Kc4h6 | 0.008 0 | 0.000 0 | 0.000 0 | 0.000 0 |
4/h | Kc4h7 | 0.007 0 | 0.000 0 | 0.000 0 | 0.000 0 |
1/d | Kc1d1 | 0.000 0 | 0.014 3 | 0.000 0 | 0.000 0 |
1/d | Kc1d2 | 0.000 0 | 0.007 2 | 0.000 0 | 0.000 0 |
1/d | Kc1d3 | 0.000 0 | 0.000 0 | 0.000 0 | 0.000 0 |
1/d | Kc1d4 | 0.000 0 | 0.007 2 | 0.000 0 | 0.000 0 |
1/d | Kc1d5 | 0.000 0 | 0.002 1 | 0.000 0 | 0.000 0 |
1/d | Kc1d6 | 0.000 0 | 0.000 0 | 0.000 0 | 0.000 0 |
1/d | Kc1d7 | 0.000 0 | 0.001 5 | 0.000 0 | 0.000 0 |
2/d | Kc2d1 | 0.012 0 | 0.0000 | 0.000 0 | 0.000 0 |
2/d | Kc2d2 | 0.000 0 | 0.000 0 | 0.000 0 | 0.000 0 |
2/d | Kc2d3 | 0.000 0 | 0.000 0 | 0.000 0 | 0.000 0 |
2/d | Kc2d4 | 0.000 0 | 0.000 0 | 0.000 0 | 0.000 0 |
2/d | Kc2d5 | 0.000 0 | 0.000 0 | 0.000 0 | 0.000 0 |
2/d | Kc2d6 | 0.000 0 | 0.000 0 | 0.000 0 | 0.000 0 |
2/d | Kc2d7 | 0.000 0 | 0.000 0 | 0.000 0 | 0.000 0 |
喹烯酮作为一种新兽药饲料添加剂，有明显的防病和促生长作用。作为一种新兽药，必须建立起其食用动物组织中的含量测定方法，并制定其最低残留限量，确定其休药期以监测其残留，以保证动物性食品的安全。
喹烯酮水溶性极小，动物机体吸收也少，因此，动物可食组织中其含量应当较小，这样就要求建立起的食用动物组织中含量测定方法必须灵敏度高、检测限低、方便、重复性好。本测定方法的关键是如何从组织中提取喹烯酮。利用喹烯酮的酯水分配系数的特性，经多步分离提取杂质或喹烯酮最终达到提取样品的目的。不过，在脂肪的处理过程中，由于其油脂含量高，故在制样方法中删掉了乙酸乙酯处理后加氯仿和水的一步。选用苯基柱，使喹烯酮的顺反结构不发生分离，即为一个峰，利于检测。
从本测定方法的结果来看，其检测灵敏度高，脂肪、肝脏、肾脏、肌肉均为0.004μg/g，回收率高，肌肉为99.23%±2.75%，脂肪为105.15%±8.65%，肝脏为93.55%±11.16%，肾脏为104.10%±9.80%，重复性好，日内测得的各组织各浓度的RSD均小于5.1%，日间测得各组织各浓度的RSD均小于8.5%，标准曲线线性好，r均为0.99以上。因此，该测定方法符合兽药残留试验技术规范的要求。
从2.5个月饲喂后个体动物可食用组织中所含喹烯酮的水平来看，喹烯酮在肌肉皮脂中1 d后均无残留，而在肝脏和肾脏中的残留量也很小，2d以后再无残留，这与喹烯酮代谢动力学研究的结果，即喹烯酮生物利用度很低(鸡仅为30%)相一致[6]。
喹烯酮对大鼠的最大无作用剂量为32.0 mg/kg(每千克体重的药量)，ADI(日许量)为无作用剂量的1/100，即ADI为0.32mg/kg，对60 kg重的成年人来说ADI值为0 mg～19.2mg。结合美国食品和药物管理局准则《用于食用性动物的化合物安全性评价的一般原则》所采用的消费因子，建议肝中的最高残留量(MRLS)为18.000mg/kg，肾脏为5.000 mg/kg，脂肪为0.700 mg/kg，肌肉为0.500mg/kg，那么，由此产生的使人类每日摄入喹烯酮的最大量可能为2.235 mg，此量远远低于计算的ADI值19.2 mg(表2)。
表2 食用组织中人类每日摄入喹烯酮的最大量
Table 2 The maximum quinocetone intaked by human everyday in edibletissue
组织 Tissue | 假定的日消费量/g Assumed consumption quanitity | 建议MRLS值/(mg·kg－1) Recommendating MRLS value | 喹烯酮的总摄入量/mg Total intake of quinocetone |
肌肉 Muscle | 300 | 0.500 | 0.150 |
肝脏 Liver | 100 | 18.000 | 1.800 |
肾脏 Kidney | 50 | 5.000 | 0.250 |
皮脂 Sebum | 50 | 0.700 | 0.035 |
总计 Total | 0.5 | 2.235 |
从法规的角度，肝组织为靶组织，喹烯酮原形为标示残留物(RM)，RM对总残留的比率为0.33，肝容许量为62.0mg/kg，肾容许量为128.0 mg/kg，肌肉容许量为21.3 mg/kg，皮脂容许量为128.0mg/kg。从表1看出，停药后4 h所有可食用鸡组织中喹烯酮浓度均低于计算所得的安全组织浓度，故该药在鸡使用上无休药期，即休药期为0d。