志贺样毒素Ⅱ型变异体(Shiga liketoxin，SLT-Ⅱe）主要由出血性大肠杆菌(EHEC)产生，为猪水肿病的主要毒力因子。试验研究表明，SLT-Ⅱe能抑制大鼠肠黏膜微血管内皮细胞（ratintestinal mucosa microvascular endothelial cells,RIMMVECs）的增殖，并可对其造成一定损伤。而适宜苦参水煎液不但可以促进RIMMVECs增殖，更可以减弱SLT-Ⅱe对RIMMVECs的损伤。本试验通过对苦参水煎液及其主要成分与SLT-Ⅱe共同作用于RIMMVECs后，不同时间段细胞上清夜中NO、ET-1分泌量的检测，旨在从细胞水平探寻苦参抗SLT-Ⅱe致RIMMVECs的损伤机理，并对其有效成分进行研究，为中药对抗细菌毒素及防治细菌病的研究提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
DMEM（Gibico）；标准胎牛血清（Gibico）；SLT-Ⅱe液（扬州大学微生物实验室惠赠）；大鼠肠粘膜微血管内皮细胞（北京农学院中兽医实验室提供）；NO试剂盒（深圳晶美）；ET-1（内皮素-1）试剂盒（北京尚柏生物公司）；噻唑蓝（MTT，Amresco）；二甲基亚砜（DMSO，Sigma）；所有试剂均经过0.22μm孔径的滤膜过滤除菌。
1.2 仪器
培养板（Costar）；96孔酶标板（Costar）；CO2培养箱（Sanyo)；荧光倒置数码显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司）；酶联免疫检测仪（BioRad）；分光光度计(UNICO)
1.3 方法
1.3.1 细胞传代接种：选取第10代的细胞进行消化，所得细胞液用完全培养基稀释，将细胞密度调整到5×104?个/mL，充分混匀后接种至96孔细胞培养板中，每个孔接种200 μl，然后置入CO2 培养箱中静止培养48 h。
1.3.2 分组方案：共分5组，每组5个重复（其中12 h各细胞组在一块细胞培养板上）。分组及各组毒素与中药液终浓度如下。空白组：维持培养基；毒素组：维持培养基中含SLT-Ⅱe 含量为10.0μg/m；毒素+苦参水煎液组：维持培养基中含SLT-Ⅱe 10.0 μg/mL，苦参200.0μg/mL；毒素+苦参碱组：维持培养基中含SLT-Ⅱe 10.0 μg/mL，苦参碱200.0μg/mL；毒素+氧化苦参碱组：维持培养基中含SLT-Ⅱe 10.0 μg/mL，氧化苦参碱200.0 μg/mL
1.3.3 NO、ET-1的测定：将96孔细胞培养板置入CO2培养箱中，37 ℃静置培养24h，待细胞生长到80%铺满培养孔底壁。如分组剂量更换培养液后，继续培养。在细胞培养的3、6、9、12h，从各大组中选取一个小组的5个孔，吸出全部细胞培养液250 μl，3000 rpm离心10min后，将上清液移入新的小离心管中，封口，-20℃冰箱保存备用。依试剂盒说明书完成细胞上清液中NO、ET-1的测定，其中ET-1每组3个重复。
1.3.4 12h增值率的测定：在12 h后，将12 h组的各孔细胞上清夜吸净后，加入5 mg/mL的MTT 30 ml及150ml的DMEM维持培养基，继续培养4 h后，轻轻吸弃孔内液体，每孔加入150 μl DMSO，37 ℃孵育30 min以上，使细胞内结晶充分溶解，于酶标仪570 nm波长测定细胞增殖率（OD值）。
1.4 数据统计
试验结果采用平均值±标准误表示，试验组间差异采用t检验法。
2．结果
2.1 苦参水煎液及其成份抗SLT-Ⅱe对RIMMVECs增殖作用
由表1可以看出，当SLT-Ⅱe浓度为10 μg/mL时，毒素作用RIMMVECs 12h后，MTT法测细胞增殖率OD值与空白对照组比较明显降低，且差异极显著。而毒素+苦参水煎液组、毒素+苦参碱组、毒素+氧化苦参碱组在12h时的OD值均显著高于毒素组，其中毒素+苦参水煎液组、毒素+苦参碱组与空白组比较无显著差异，而毒素+氧化苦参碱组与空白组比较差异极显著，与毒素+苦参水煎液组、毒素+苦参碱组与空白组比较差异亦极显著。
表1 苦参水煎液及其成份抗SLT-Ⅱe对RIMMVECs增殖作用( n = 5 )
组别 | X ± S | 增殖率% | 统计结果 |
空白组 | 2.88±0.12 | — | A?? a |
毒素组 | 2.32±0.07 | -19.53 | C?? c |
毒素+苦参水煎液组 | 2.79±0.06 | -2.95 | A?? a |
毒素+苦参碱组 | 2.80±0.07 | -2.61 | A?? a |
毒素+氧化苦参碱组 | 2.56±0.04 | -10.91 | B?? b |
2.2 苦参水煎液及其成份对SLT-Ⅱe引起RIMMVECs分泌NO的影响
由表2可以看出，空白组NO分泌量随着时间的增加而增加，呈逐渐上升的趋势，且上升趋势平缓。而毒素组，除在3h时，NO分泌量与空白组没有明显差异，在6h、9h、12h时均较空白对照组明显升高，且差异极显著。而在各个时间点，三个中药组毒素+苦参水煎液组、毒素+苦参碱组、毒素+氧化苦参碱组的NO分泌量均落在毒素组与空白组之间。3h时，各个组NO分泌量间没有明显差异。在6h时，三个中药组NO分泌量与毒素组比较，差异极显著；其中，毒素+苦参碱组与空白组比较差异显著。在9h时，三个中药组NO分泌量与毒素组比较，差异极显著；其中毒素+氧化苦参碱组与空白组比较差异极显著。12h时，三个组与毒素组比较，差异极显著，其中毒素+氧化苦参碱组与空白组差异极显著。三者间比较，除在12h时，毒素+苦参碱组与毒素+氧化苦参碱组间差异显著外，其他均无显著差异。
表3-12 苦参水煎液及其成份SLT-Ⅱe引起RIMMVECs分泌NO的影响（X±S μmol/L，n = 5）
组别 | 3 h | 6 h | 9 h | 12h |
空白组 | 9.45±1.54 A a | 11.71±0.72 B c | 13.10±1.63 Cc | 15.11±1.67 C d |
毒素组 | 10.08±1.61 A a | 17.13±1.75 A a | 18.14±1.21 A a | 23.05±2.30 A a |
毒素+苦参水煎液组 | 9.70±1.00 A a | 12.59±1.26 Bbc | 14.61±1.29 BCbc | 17.88±1.70 BCbc |
毒素+苦参碱组 | 9.95±1.13 A a | 13.60±1.14 B b | 14.11±0.84 BCbc | 16.75±1.70 BCcd |
毒素+氧化苦参碱组 | 9.82±1.31 A a | 12.97±1.38 Bbc | 15.87±1.50 AB b | 19.40±0.93 B b |
2.3 苦参水煎液及其成份对SLT-Ⅱe引起RIMMVECs分泌ET-1的影响
由表3可以看出，而对于ET-1的分泌量，空白组随着时间的增加而没有明显变化。毒素组，在3h时，ET-1分泌量与空白组比较明显降低，且差异极显著。而在6h、9h、12h时，毒素组ET-1又明显上升，与空白对照组比较差异极显著。对于中药组，在3h时，毒素+苦参水煎液组、毒素+苦参碱组、毒素+氧化苦参碱组的ET-1分泌量均高于毒素组，且差异极显著；其中毒素+苦参水煎液组、毒素+苦参碱组与空白组比较差异极显著。三者间比较，毒素+氧化苦参碱组与其他两组比较差异极显著。从6h后，三个中药苦参组ET-1的分泌量即落在毒素组与空白组之间。在6h时，三个组ET-1分泌量与毒素组和空白组比较，差异均极显著。三者间比较差异都极显著。在9h时，三个中药组ET-1分泌量与毒素组和空白组比较，差异均极显著。三者间比较，毒素+氧化苦参碱组与其他两组比较差异极显著。12h时，三个中药组ET-1分泌量与空白组比较，差异极显著；其中毒素+苦参水煎液组、毒素+苦参碱组ET-1分泌量与毒素组比较，差异极显著。三者间比较差异都极显著。
表3-13 苦参水煎液及其成份对SLT-Ⅱe引起RIMMVECs分泌ET-1的影响（X±S pg/mL，n = 3）
组别 | 3 h | 6 h | 9 h | 12 h |
空白组 | 1.73±0.12 B b | 1.99±0.11 E e | 2.06±0.15 D d | 2.01±0.14 D a |
毒素组 | 0.90±0.11 C c | 6.62±0.14 A a | 7.10±0.16 A a | 6.62±0.21 A a |
毒素+苦参水煎液组 | 2.09±0.14 A a | 5.18±0.20 C c | 5.18±0.15 C c | 5.13±0.21 B b |
毒素+苦参碱组 | 2.16±0.14 A a | 4.69±0.11 D d | 4.97±0.23 C c | 3.88±0.11 C c |
毒素+氧化苦参碱组 | 1.71±0.11 B b | 5.77±0.07 B b | 5.99±0.14 B b | 6.36±0.11 A d |
3 分析与讨论
本实验用MTT法观察SLT-Ⅱe对RIMVECs增殖的影响。从细胞增值率的角度出发，毒素＋中药组中，在毒素+苦参水煎液组、毒素+苦参碱组、毒素+氧化苦参碱组在12h时的OD值均显著高于毒素组。表明在12 h时，200μg/mL的苦参水煎液、苦参碱、氧化苦参碱对SLT-Ⅱe引起的内皮细胞损伤均起到了保护作用，降低由毒素引起的增殖抑制。
NO是血管内皮细胞所产生的内皮衍生性舒张因子，具有很强的舒血管功能[1]。ET-1是迄今为止已知最强的血管收缩性物质[2]。二者相互作用，维持血管的舒缩及通透性。试验结果表明，10μg/mL的SLT-Ⅱe在作用于RIMMVECs后，首先表现出在3 h时ET-1分泌量显著下降，NO无明显变化。而在6h后，NO与ET-1较空白组均显著升高。其原因可能是由于毒素作用细胞后，首先引起ET-1的迅速降低，从而导致NO、ET-1比例失衡，血管迅速扩张，致使内皮细胞发生损伤，而后NO持续生成，并转化为具有更强细胞毒性的ONOO－，从而加剧了细胞的损伤与死亡[3]。而200μg/mL的苦参水煎液可在3 h时明显抑制因毒素作用所致的细胞上清液中ET-1的降低，并在3 h、6 h、9 h、12h时不同程度的降低了毒素作用后细胞上清液中NO的分泌量，维持了NO与ET-1在细胞外环境的平衡，从而减轻了毒素对细胞的损伤作用。苦参两种主要成分苦参碱和氧化苦参碱对NO、ET-1的作用趋势与苦参水煎液基本相同。在12h时苦参碱对RIMMVECs的增殖效果来看略高于苦参水煎液组，但极显著高于氧化苦参碱组。而其在对ET-1及NO的调控作用也好于氧化苦参碱组，故在200μg/mL浓度条件下，苦参碱在苦参对抗SLT-Ⅱe保护RIMMVECs的功效中发挥主要作用。
综上所述，SLT-Ⅱe作用细胞后可在短时间内引起ET-1的迅速降低，从而导致NO、ET-1比例失衡，血管迅速扩张，致使内皮细胞发生损伤，NO分泌量开始逐渐增加。而随着NO量的增加，进一步加剧了细胞的损伤。而苦参则在SLT-Ⅱe作用最初阶段抑制ET-1的降低、维持NO、ET-1比例平衡，在后期降低NO的分泌量，起到保护内皮细胞的作用。其中苦参碱较之氧化苦参碱保护效果更为突出。