方剂是在中（兽）医理论指导下，辨证论治的基础上，根据动物病情需要选择适当的（两位或多味）中药，酌定用量，按照一定的组成原则，配伍组合而成。药物决定方剂的功效，方剂中药味的增加或减少以及用量，可导致方剂配伍关系和功效变化。在中药方剂及新药研究中，虽可根据中兽医理论和临床经验选择药物和组方，但中药方剂多为复方且药物剂量不一，即存在多因素多水平特点[1]，为中兽药作用机理研究、中药现代化和新药开发及其产业化带来很多困难。正交试验设计是采用规格化的正交表，使试验因素和水平得到合理安排，并通过试验结果分析各因素对试验观察指标的影响，分清各因素之间的主次关系和交互作用，确定各因素不同水平的最佳组合，是多因素多水平试验效率最高的设计方法。
热应激可引起动物免疫机能下降，如引起小鼠胸腺指数、脾脏指数、淋巴细胞增殖活性、IL-2浓度及其受体表达均出现下降[2]，诱导胸腺细胞和脾脏细胞的凋亡，并引起动物胸腺和脾脏萎缩[3]，还可通过下丘脑－垂体－肾上腺皮质轴引起皮质醇水平升高而影响动物正常的生理和免疫功能[4~6]。因此，本试验在中兽医方剂“君、臣、佐、使”组方原则的指导下，采用正交设计法研究藿香、苍术、黄柏和石膏四种中药有效部位不同组合以及不同水平对热应激后小鼠肠道淋巴细胞增殖的影响，旨在探讨中药有效部位复方组方机制。
1 材料与方法
1.1药品与试剂
中药有效部位：石膏水提物（gypsum fibrosumwater extract, GFWE）（硫酸钙含量为92%）、黄柏生物碱（cortex phellodendri‘salkaloid, CPA）（小檗碱含量为42.0%）、藿香挥发油包合物（herba agastachis‘saetherolea, HAA）（百秋里醇含量30.47%）、苍术挥发油包合物（rhizoma atractylodi’saetherolea,RAA）（β-桉叶油醇含量33.63%）均由本课题组制备和定量测定，临用前分别用RPMI-1640基础培养基配制成1mg/ml。
RPMI-1640基础培养基、Hank’s干粉为Hyclone公司产品；小牛血清，购自北京元亨圣马生物技术研究所；二硫苏糖醇（DTT），购自北京科昊泽生物技术有限公司；噻唑蓝（MTT）、二甲基亚枫（DMSO），购自Amresco公司；Ⅱ型胶原酶、EDTA、植物血凝素（PHA）购自Sigma公司；小鼠淋巴细胞分离液，购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司。
1.2 试验方法
1.2.1 小鼠肠道淋巴细胞分离与培养
参照文献方法[7,8]分离肠道淋巴细胞，即脱臼处死18~22gBALB/c鼠，置于75%酒精中浸泡5min，取出十二指肠到回盲肠结之间的肠道组织；用含有1000IU双抗的Hank’s洗涤液反复冲洗；将肠道组织块剪成1×1cm2大小置于含1000IU双抗、5%小牛血清Hank’s洗涤液中浸泡5min，反复3次；加入20ml37℃ EDTA-DTT消化液，间断振荡消化30min，收集消化液1000rpm离心5min以获取淋巴细胞；向剩余组织块中加入20ml37℃的0.1%Ⅱ型胶原酶液，37℃恒温振荡水浴锅中以250rpm振荡消化40min；将剩余消化液经2层无菌医用纱布过滤；10000rpm离心滤液5min，收集细胞后用完全培养基洗涤2次；将两次收集的淋巴细胞悬液缓慢加入到淋巴细胞分离液上层，以2000rpm离心20min，收集淋巴细胞分离液层和培养液中间的淋巴细胞层；用10%小牛血清RPMI-1640完全细胞培养基以1000rpm离心5min方式洗涤淋巴细胞2次，并经玻璃纤维棉柱过滤；经0.3%台盼蓝拒染法计算细胞活力＞90%后，用10%小牛血清完全培养基调整淋巴细胞数量为1×106个/ml，按照0.5ml/孔加入96孔细胞培养板后，置37℃、5%CO2培养箱中培养。
1.2.2 正交试验设计
根据正交试验设计要求，考察藿香挥发油、苍术挥发油、黄柏生物碱和石膏水提物不同水平组方对热应激小鼠肠道淋巴细胞增殖的影响。即A，B，C，D，A×B，A×C，B×C，选用正交表L8（27）。因需考察A×B，就先将A放在第1列，B放在第2列由L8（27）交互作用列表查出A×B在第3列；将C放在第4列，同法查出A×C在第5列，B×C在第6列，D放在第7列。因素水平、表头设计和试验方案见表1和表2。
表1因素和水平表
因素 factor | 藿香 HAA | 苍术 RAA | 黄柏 CPA | 石膏 GFWE |
种类type | A | B | C | D |
1 | 200mg/ml | 200mg/ml | 200mg/ml | 100mg/ml |
2 | 100mg/ml | 100mg/ml | 100mg/ml | 50mg/ml |
表2表头设计和试验方案表
列array | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
因子 factors | 藿香 HAA | 苍术 RAA | 藿香×苍术 HAA×RAA | 黄柏 CPA | 藿香×黄柏 HAA×CPA | 苍术×黄柏 RAA×CPA | 石膏 GFWE |
1 2 3 4 5 6 7 8 | 1（200） 1（200） 1（200） 1（200） 2（100） 2（100） 2（100） 2（100） | 1（200） 1（200） 2（100） 2（100） 1（200） 1（200） 2（100） 2（100） | 1 1 2 2 2 2 1 1 | 1（200） 2（100） 1（200） 2（100） 1（200） 2（100） 1（200） 2（100） | 1 2 1 2 1 2 1 2 | 1 2 2 1 1 2 2 1 | 1（100） 2（50） 2（50） 1（100） 2（50） 1（100） 1（100） 2（50） |
1.2.3 小鼠肠道淋巴细胞处理与数据处理
向分离获得的小鼠肠道淋巴细胞悬液中加入不同浓度中药有效部位组合复方以及1mg/mlPHA后，用10%小牛血清RPMI-1640完全培养基补足至1ml，将小鼠肠道淋巴细胞放于43℃热应激1h后于37℃、65%湿度条件下培养44h，加入10ml5mg/ml的MTT液于37℃、65%湿度条件下培养4h，加入100mlDMSO混匀于570nm波长检测OD值。数据用SPSS11.5统计软件按照正交设计法进行方差分析。
2.结果与分析
2.1直观分析
表3 中药有效部位复方对热应激小鼠肠道淋巴细胞增殖的影响（直观分析表）
药物与交互作用 Medicine and interaction | 藿香 HAA | 苍术 RAA | 藿香×苍术 HAA×RAA | 黄柏 CPA | 藿香×黄柏 HAA×CPA | 苍术×黄柏 RAA×CPA | 石膏水提物 GFWE | T细胞增殖 Proliferation of T lymphocyte |
1 2 3 4 5 6 7 8 | 1 1 1 1 2 2 2 2 | 1 1 2 2 1 1 2 2 | 1 1 2 2 2 2 1 1 | 1 2 1 2 1 2 1 2 | 1 2 1 2 2 1 2 1 | 1 2 2 1 1 2 2 1 | 1 2 2 1 2 1 1 2 | 0.303 0.295 0.301 0.284 0.294 0.282 0.302 0.285 |
T1 T2 R | 1.183 1.163 0.02 | 1.174 1.172 0.002 | 1.185 1.161 0.024 | 1.2 1.146 0.054 | 1.171 1.175 -0.004 | 1.166 1.18 -0.014 | 1.171 1.175 -0.004 | 2.346 |
据表3结果直观分析可知，黄柏和藿香的极差大，故黄柏和藿香作为主药，且分别以1水平，即200mg/ml对小鼠肠道T淋巴细胞增殖促进作用最大；苍术和石膏为次要药物，其水平分别选1水平，即分别为200mg/ml和100mg/ml。即最佳组方为A1B1C1D1，以中药有效部位复方1对热应激小鼠肠道T淋巴细胞增殖影响最大。
2.2 方差分析
表4 中药有效部位复方对热应激小鼠肠道T淋巴细胞增殖的影响
列号 Array | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
药物与交互 | A | B | A×B | C | A×C | B×C | D |
Ri2 | 0.0004 | 0.000004 | 0.000576 | 0.002916 | 0.000016 | 0.000196 | 0.000016 |
SSi= Ri2/8 | 0.00005 | 0.0000005 | 0.000072 | 0.0003645 | 0.000002 | 0.0000245 | 0.000002 |
注：表中为Ri2各种药物极差的平方，SSi公式中8为复方总数。
各处理因素自由度（df）＝水平数－1
各因素的均方（MS）＝SS/df
计算误差列离均差平方和（SSe）、自由度（dfe）和均方（MSe），公式同上。即SSe＝?SS（SS2＋SS5+SS7）；dfe＝1+1+1＝32；MSe＝SSe/3＝0.0000015
F检验。F＝MS/MSe
结果判断：可查F值表。如F<F0.05，P>0.01，差别无显著；F>F0.05，P<0.05，差异显著；F>F0.01，P<0.01，差异极显著。
选择离差平方和较小的SS2、SS5和SS7作为误差，计算各因子F值，并对药物的2个水平的作用评定，分析最佳交互列作用，以找出最佳剂量的最佳配伍。
表5 中药有效部位复方对热应激小鼠肠道T淋巴细胞增殖影响方差分析表
变异来源 | SS | df | MS | F | P | F0.05(1, 3) | F0.01(1, 3) |
A B A×B C A×C B×C D | 0.00005 0.0000005 0.000072 0.0003645 0.000002 0.0000245 0.000002 | 1 1 1 1 1 1 1 | 0.00005 0.000072 0.0003645 0.0000245 | 33.33 48.00 243.00 16.33 | <0.05 <0.01 <0.01 <0.05 | 10.1 | 34.1 |
误差 | SS2+SS5+SS7＝0.0000045 | 3 | 0.0000015 |
表6 藿香和苍术（A×B）对热应激小鼠肠道T淋巴细胞增殖的交互作用分析
A1（藿香200mg/ml） A1(HAA 200mg/ml) | A2（藿香100mg/ml） A2(HAA 100mg/ml) | |
B1（苍术200mg/ml） B1 (RAA200mg/ml) | 0.303+0.295=0.598 | 0.294+0.282=0.576 |
B2（苍术100mg/ml） B2 (RAA100mg/ml) | 0.301+0.284=0.585 | 0.302+0.285=0.587 |
由表5可知，对热应激小鼠肠道T淋巴细胞增殖影响较大的药物有效部位是黄柏生物碱及藿香挥发油（F值分别为243.00和33.33）。交互作用较好的交互列依次为：A×B（藿香和苍术）和B×C（苍术和黄柏）。由表6可知，苍术挥发油和藿香挥发油的浓度增加，对热应激后小鼠肠道T淋巴细胞增殖具有较大影响，以藿香挥发油浓度增加效果尤为明显。
综合直观分析、方差分析和交互作用分析，即认为藿香、苍术、黄柏和石膏四味中药有效部位复方对热应激后小鼠肠道T淋巴细胞增的最优组合为A1B1C1D1，即藿香挥发油200mg/ml、黄柏200mg/ml、苍术挥发油200mg/ml、石膏水提物100mg/ml。
3 讨论
肠道黏膜免疫系统包括三种淋巴细胞：分布于肠道黏膜上皮细胞内的淋巴细胞，即上皮内淋巴细胞（IEL）、固有层淋巴细胞（LPL）、集合淋巴结（PP结）淋巴细胞，构成肠道黏膜免疫主要部分，其功能的正常对于维护肠道黏膜免疫功能具有重要作用；夏季高温气候易引起动物产生热应激，导致其免疫力下降而给畜牧生产带来巨大损失[2～6]。根据中兽医理论，我国大部分养猪场夏季环境多属于高温高湿环境，常被认为是湿热之邪。夏季动物产生热应激与饲养环境因素有关，即感受湿热病邪。湿热病邪常从上焦而入，也可直中中焦，后入下焦，由表及里；湿热之邪常郁阻中焦脾胃，导致中焦脾胃运化功能障碍，且湿为阴邪，热为阳邪，二者属性不一，故病程中出现湿偏重、热偏重或者湿热并重等类型。因此，在防治中常采用清热祛湿原则。本试验中拟方为藿香、黄柏、苍术、石膏四味药组成，主功效为清热泻火、解表和中、燥湿健脾，用于动物在夏季高温高湿环境感受湿热之邪后出现的湿热证。方中藿香芳香化浊，开胃止呕，发表解暑及醒脾理湿；黄柏苦寒，入肾、膀胱经和大肠经，主泻下焦火，具有清湿热、泻火解毒功效，使湿热下泄，与藿香共为方中主药。苍术燥湿以健脾，祛风湿，臣药；石膏辛甘大寒，具有清泄气分实热，为佐使药。
目前对中药复方的药理研究方法可分为全方研究和拆方研究。全方有助于药效学研究，但不利于研究中药复方的组方规律；拆方研究可说明中药复方的配伍关系和组方理论，主要通过正交试验法和拆方分析法[9]进行。本试验中采用的正交试验法是按照一定的正交试验设计表将一个方剂中的药物（因素）和剂量（水平）按照一定规律设置，遵循这种规律性设计，以最少的实验次数得出尽可能最佳的试验结果；试验结果经过直观分析、方差分析和交互分析确定藿香、苍术、黄柏和石膏有效部位组成复方的最优组合是A1B1C1D1，即藿香挥发油200mg/ml、黄柏生物碱200mg/ml、苍术挥发油200mg/ml、石膏水提物100mg/ml；对热应激小鼠肠道T、B淋巴细胞增殖交互作用较好的是藿香挥发油和苍术挥发油，且以苍术挥发油剂量增加则效果较好；且以黄柏生物碱对热应激小鼠肠道T、B淋巴细胞增殖影响最大，藿香挥发油影响居其次，二者共为方中主药，而苍术挥发油和石膏水提物对T、B淋巴细胞增殖影响较小，作为臣、佐药，与中兽医对热应激的辨证论治结果一致；以藿香挥发油和苍术挥发油交互效果最好，且以苍术挥发油剂量增加则效果较好，说明中药有效部位剂量在组方中的剂量效应的重要性，同时也说明了中药有效部位具有中药特性，且其复方可显著促进热应激小鼠肠道T淋巴细胞增殖。
根据正交法设计的试验，其试验点均衡分布，代表性强，可以最大限度节约人力、物力、时间，同时可以避免完全设计方法的盲目性，且试验结果分析具有计算简单和结论可靠的特点[10]。对于正交试验设计中的因素选择必须在专业知识（中兽医理论）指导下进行筛选，使其具有可控性和独立性，水平的选择应该具备合理性，符合专业理论知识和实践经验的要求，否则易导致无效结果出现[11，12]。因此，根据中兽医辨证和方剂理论，及正交试验设计法确定不同组成中药有效部位复方，利用热应激引起肠道淋巴细胞增殖抑制模型，筛选确定中药有效部位复方组成和剂量，可作为探讨中药方剂组方机制和中药方剂现代开发一条重要途径。