本法是用分光光度法测定维生素A在特定波长处的吸收度来计算其含量，以单位表 示，每单位相当于全反式维生素A醋酸酯0.344μg或全反式维生素A醇0.300μg。
由于维生素A制剂中含有稀释用油和维生素A原料药中混有其他杂质，所测得的吸收度不是维生素A独有的吸收。在以下规定的条件下，非维生素A物质的无关吸收所引入的误差可以用校正公式校正，以便得到正确结果。
校正公式系采用三点法，除其中一点是在吸收峰波长处测得外，其他两点分别在吸收峰两侧的波长处测定，因此仪器波长若不够准确时，即会有较大误差，故在测定前，应校正仪器波长。
测定应在半暗室中尽速进行。
合成维生素A和天然鱼肝油中的维生素A是酯式维生素A。如供试品中干扰测定的杂质较少，能符合下列第一法测定的规定时，可直接用溶剂溶解供试品后测定；否则应按第二法，经皂化提取，除去干扰后测定。
第一法
取供试品适量，精密称定，加环己烷溶解并定量稀释制成每1ml中含9～15单位的溶液，照分光光度法（附录Ⅳ Ａ）,测定其吸收峰的波长，并在下列各波长处测定吸收度，计算各吸收度与波长328nm处吸收度的比值和波长328nm处的E1％ 1cm值。
波长, nm 吸收度比值 波长, nm 吸收度比值
300 0.555 340 0.811
316 0.907 360 0.299
328 1.000
如果吸收峰波长在326～329nm之间，且所测得各波长吸收度比值不超过上表中规定的±0.02，可用下式计算含量：
每1g供试品中含有的维生素A的单位＝E1％ 1cm(328nm)×1900
如果吸收峰波长在326～329nm之间，但所测得的各波长吸收度比值超过表中规定值的±0.02，应按下式求出校正后的吸收度，然后再计算含量。
A<<328>>(校正)＝3.52(2A<<328>>－A<<316>>－A<<340>>)
如果校正吸收度与未校正吸收度相差不超过±3.0％,则不用校正吸收度，仍以未经校正的吸收度计算含量。
如果校正吸收度与未校正吸收度相差在－15％至－3％之间,则以校正吸收度计算含量。
如果校正吸收度超过未校正吸收度的-15％或+3％,或者吸收峰波长不在326～329nm之间，则供试品须按下述第二法测定。
第二法
精密称取供试品适量(约相当于维生素A总量500单位以上,重量不多于2g),置皂化瓶中，加乙醇30ml与50％(g/g)氢氧化钾溶液3ml，置水浴中煮沸回流30分钟，冷却后，自冷凝管顶端加水10ml冲洗冷凝管内部，将皂化液移至分液漏斗中（分液漏斗活塞涂以甘油淀粉润滑剂）,皂化瓶用水60～100ml分数次洗涤，洗液并入分液漏斗中，用不含过氧化物的乙醚振摇提取4次，每次振摇约5分钟，第一次60ml，以后各次40ml，合并乙醚液，用水洗涤数次，每次约100ml，洗涤应缓缓旋动，避免乳化,直至水层遇酚酞指示液不再显红色，乙醚液用铺有脱脂棉与无水硫酸钠的滤器滤过，滤器用乙醚洗涤，洗液与乙醚液合并，放入250ml量瓶中，用乙醚稀释至刻度，摇匀；精密量取适量,置蒸发皿内,在水浴上低温蒸发至5ml后，置减压干燥器中，抽干，迅速加异丙醇溶解并定量稀释制成每1ml中含维生素A9～15单位，照分光光度法(附录Ⅳ Ａ),在300、310、325与334nm四个波长处测定吸收度 ，并测定吸收峰的波长。吸收峰的波长应在323～327nm之间，且300nm波长处的吸收度与325nm波长处的吸收度的比值应不超过0.73，按下式计算校正吸收度。
A<<325>>(校正)＝6.815A<<325>>－2.555A<<310>>－4.260A<<334>>
每1g供试品中含有的维生素A的单位＝E1％ 1cm(325nm,校正)×1830
如果校正吸收度在未校正吸收度的±3％以内,则仍以未经校正的吸收度计算含量。
如果吸收峰的波长不在323～327nm之间，或300nm波长处的吸收度与325nm波长处的吸收度的比值超过0.73，则应自上述皂化后的乙醚提取液250ml中，另精密量取适量(相当于维生素A300～400单位)，减压蒸去乙醚至约剩5ml，再在氮气流下吹干,立即精密加入甲醇3ml，溶解后，精密量取500μl，注入维生素D测定法（附录Ⅶ K）第二法项下的净化用色谱柱系统，准确收集含有维生素A的流出液，在氮气流下吹干,而后照上述方法自“迅速加异丙醇溶解”起，依法操作并计算含量。
【附注】
（1）甘油淀粉润滑剂
取甘油22g，加入可溶性淀粉9g, 加热至140℃,保持30分钟并不断搅拌，放冷，即得。
（2）不含过氧化物的乙醚
照麻醉乙醚项下的过氧化物检查，如不合于规定,可用5％硫代硫酸钠溶液振摇，静置，分取乙醚层，再用水振摇洗涤1次，重蒸,弃去首尾5％部分，馏出的乙醚再检查过氧化物，应符合规定。
