巯嘌呤片为常用的抗肿瘤药物制剂，主要用于治疗急性白血病，收载于美国、英国和中国药典中，其含量测定方法均采用紫外分光光度法［1～3］，未见有高效液相色谱法的报道，本文介绍用高效液相色谱法测定巯嘌呤片的含量。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪：日本岛津LC-10Avp液相色谱仪，SPD-10Avp紫外检测器，Class-VP数据处理机，CTO-10Avp柱温箱。
试药：巯嘌呤、绿原酸对照品均由中国药品生物制品检定所提供；甲醇、磷酸二氢钾、磷酸均为分析纯；甲酸为色谱纯；巯嘌呤片由上海华联制药有限公司提供。
2 色谱条件
色谱柱：Shim-Pack CLC-ODS(6.0 mm×150 mm，5 μm)；流动相：甲醇-0.01 mol.L-1磷酸二氢钾(用磷酸调整pH=3.9)(25∶75)；内标：绿原酸；紫外检测波长328 nm；流速1 mL.min-1；柱温40 ℃；进样量10 μL。
3 溶液的制备
3.1 对照品溶液 精密称取巯嘌呤对照品12.5 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇20 mL于50 ℃水浴上加热溶解，放冷后，用甲醇稀释至刻度，摇匀。
3.2 内标溶液 精密称取绿原酸对照品29.5 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。
4 线性范围和校正因子的测定
精密量取对照品溶液0.25，0.5，1.0，2.0，3.0 mL分别置于10 mL量瓶中，各准确加入内标溶液1.0 mL，用含2.5%甲酸的甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜过滤，进样10 μL，记录峰面积，以对照品与内标物峰面积比值对进样浓度作线性回归，得回归方程(n=5)为：
Y=2.074 5Z+0.005 144 r=0.999 9
结果表明，巯嘌呤浓度在6.3～75.6 μg.mL-1范围内有良好的线性关系。经测定，校正因子为0.406 9(n=6),RSD=0.17%。
5 样品的测定
取本品10片，精密称定研细，精密称取适量(约相当于巯嘌呤50 mg)置100 mL量瓶中，加甲醇60 mL，于50 ℃水浴中加热，并超声5 min使巯嘌呤溶解，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液1.0 mL，置10 mL量瓶中，准确加入内标溶液1.0 mL，用含2.5%甲酸的甲醇溶液稀释至刻度，得样品溶液，经0.45 μm微孔滤膜过滤，进样10 μL，记录色谱图，见图1。
图1 对照品(A)、样品与内标(B)色谱图
1.巯嘌呤(4.0 min) 2.绿原酸(内标，5.3 min)
按内标法以峰面积计算含量，并与中国药典的紫外分光光度法测定的结果作比较，结果基本一致，见表1。
6 加样回收率的测定
取已知含量的片剂粉末适量(约1/10片)共3份，精密称定，置25 mL量瓶中，各准确加入对照品5.04，7.56，10.08 mg，加甲醇15 mL，照“样品测定”项下操作，每份测定2次，结果回收率在99.95～101.1之间，RSD小于0.82%。
表1 本法与紫外分光光度法测定结果比较
(标示量%，n=3)
批 号
本 法
紫外分光光度法
1
97.78 (0.42)
97.80
2
98.82 (0.35)
98.91
3
97.66 (0.48)
97.72
注：括号内为RSD值(%)
7 稳定性实验
取样品溶液分别于当时及24和48 h后进样，结果巯嘌呤与内标的峰面积比值基本一致。
8 讨论
8.1 由于巯嘌呤吸收强烈(E1%1 cm=1 165),，故选择的检测波长(328 nm)并不是巯嘌呤的最大吸收波长(325 nm)，而是绿原酸的吸收波长，以提高内标物的响应灵敏度和测定结果的准确性。
8.2 为改善内标物绿原酸的峰形和减少拖尾，经多次试验以加入含2.5%甲酸的甲醇溶液后得到比较满意的效果，分离度由原来的2.7达到4.3，塔板数由原来的1 307增加到4 600，甲酸的加入增加了绿原酸的稳定性。
赵永成（云南省昭通地区药品检验所 昭通 657000）