基线漂移在大多数的核苷酸HPLC分析中是一大问题。本文着重介绍一种解决基线漂移的方法—采用离子交换色谱和ELSD分析检测核苷酸。
核苷酸的分析是研究退化器官和异常组织的能量水平的科研工作者主要关心的课题。测定损坏的人类肌肉组织的核苷酸浓度可以揭示疾病的来源。人类心脏疾病的研究发现病变的心肌含有低水平的腺苷三磷酸(ATP)。
最近，核苷酸被用于某些疾病的治疗。AMP被用于减轻带状疱疹后神经痛，AMP亦被用于降低皮肤卟啉症患者对光的敏感性。ATP药物的制造商致力于研究提高人体吸收、分解和利用效率的方法，同时也研究AMP药物在人体中不同浓度和传递方式的影响。
现有的分析核苷酸方法包括采用磷酸缓冲液流动相和离子对试剂的HPLC分析结合UV检测；采用磷酸缓冲液流动相的HPLC分析结合PDA检测；以及离子交换色谱法结合UV检测。当采用HPLC法结合PDA检测或离子交换色谱法结合UV检测时，由于梯度洗脱造成流动相组成的变化而引起基线漂移，进而导致定量困难。
为了消除前述方法中基线漂移的问题，我们采用蒸发光散射检测器(ELSD)作为HPLC检测器。ELSD首先雾化柱洗脱液形成雾状气溶胶，气溶胶通过加热的漂移管后流动相蒸发，剩下为悬浮于溶剂蒸汽中的样品颗粒，样品颗粒散射来自于激光二极管的激光，后者被光电二极管接受后转化为电信号。ELSD是一种通用型检测器。另外，由于所有的流动相在检测前被蒸发，所以梯度洗脱造成流动相组成的变化不会影响ELSD的响应，消除了基线漂移的问题。
Alletech2000型ELSD(Alltech Associates,Deerfield,USA)能够采用两种不同的操作模式(专利申请中)，为所有应用提供最佳性能。第一种模式为关闭式撞击器(Impactor Off)，适用于非挥发性样品和/或挥发性流动相(大多为有机溶剂)；第二种模式为开启式撞击器(Impactor On)，适用于半挥发性样品和/低挥发性流动相(大多为水溶液)。
1 仪器和试药
核苷酸对照品和甲酸从Aldrich公司购得。HPLC级甲醇从Allied Inc.公司购得。去离子水采用Millipore纯水机制得。氮气从Praxair公司购得。所有样品溶解于含1%甲酸的10%甲醇水溶液。HPLC分析采用Alltech 526型二元梯度泵，580型自动进样器，2000型蒸发光散射检测器(ELSD)。Alltech在线脱气机用于流动相脱气。Perkin-Elmer Turochrom数据工作站用于采集和分析数据。
2 HPLC分析条件
采用Alltech阴离子柱，100mm×4.6mm，7μm，配以Alltech;GA-1阴离子预柱，7.5mm×4.6mm，分离AMP，GMP和UMP。采用非梯度洗脱，含1%甲酸的10%甲醇水溶液作为流动相，流速为1.0ml/min，进样量为100μL。ELSD采用关闭式撞击器。漂移管温度设定为120℃，氮气流量为3.5L./min。
采用Alltech Allsep阴离子柱，50mm×4.6mm，7μm，配以Alltech GA-1阴离子预柱，7.5mm×4.6mm，分离AMP，ADP和ATP。采用梯度洗脱，流动相为A：含5%甲酸的10%甲醇水溶液；B：含1%甲酸的10%甲醇水溶液，梯度初始条件为100%B，在3min内转为100%A，保持5min，然后再转为100%B，平衡8min。流速为2.0mL/.min，进样量为100μL。ELSD采用开启式撞击器。漂移管温度设定为40℃，氮气流量为1.75L/.min。
3 线性范围
分别测定单一核苷酸对照品标准曲线，并以此为标准测定AMP，ADP和ATP曲线，AMP分析的进样量在0.1011～1.011;mg./mL之间(0.1011，0.2022，0.5055，0.6066，0.8088和1.011mg./mL)；ADP分析的进样量在0.0814～0.814mg/.mL之间(0.0814，0.1628，0.4070，0.4884，0.6512和0.814 mg.mL-1)；ATP分析的进样量在0.0896～0.896 mg.mL-1之间(0.0896，0.1792，0.4480，0.5376，0.7168和0.896 mg/.mL)。同样方法测定AMP，GMP和UMP曲线，AMP，GMP和UMP分析的进样量在0.0100～0.100 mg/.mL之间(0.0100，0.0200，0.0300，0.0600，0.0800和0.100 mg/.mL)。每一进样量均进样4次，以mVS为坐标表示的峰面积对于进样量作图。方法的线性经统计学验证。
AMP，ADP和ATP的分离采用Allsep阴离子柱和二元梯度洗脱，表现出良好的分辨率。以三倍信噪比作为检测限，测得AMP，ADP和ATP的检测限分析是2.0，1.9，672 μg./mL。AMP，ADP和ATP的相关系数分别为0.999，0.998，0.998。
4 讨论
4.1 为了将ATP从阴离子交换柱上冲洗下来，必须采用含甲酸浓度较高的流动相和较高流速。由于AMP的保留较弱，AMP，ADP和ATP的分析需要采用梯度洗脱。又因为90%流动相是高达5%的甲酸溶液，流速是2.0 mL/.min，如果采用关闭式撞击器的模式，即使采用较高的漂移管温度和较高的气体流量，基线噪音仍然较大。而采用开启式撞击器的模式时，可使较大的流动相液滴被分流到废液，所以ELSD 2000的漂移管温度大大降低。ELSD 2000的开启式撞击器的模式对于AMP，ADP和ATP分析能获得最佳结果。
4.2 为了更好地分离AMP，GMP和UMP等单磷酸酯类，需采用较长的Allsep阴离子柱，其保留时间较短及分辨率较好。由于核苷酸的挥发性低于流动相，分析在关闭式撞击器的情况下进行。在这种情况下所有的样品被送到光电检测池。在同样的色谱条件下，ELSD 2000采用关闭式撞击器比采用开启式撞击器的模式，对核苷酸检测有更高灵敏度。AMP，UMP和GMP的检测限分别是0.5，5.0，7.6 μg.mL-1。相关系数是0.999。
4.3 开发两种离子交换色谱方法用于测定核苷酸分析。方法快速可靠，可为低至μg.mL-1浓度的AMP，ADP，UMP和GMP的分析提供良好的保留时间和分辨率。ATP和阴离子交换柱的亲和性高，所以检测限也高，峰形较宽。ELSD 2000开启式撞击器模式为AMP，ADP和ATP的分析提供最佳检测响应。ELSD 2000关闭式撞击器模式为AMP，UMP和GMP的分析提供最佳检测响应。