关键词：注射用双连翘；鸡胚成纤维细胞；新城疫病毒。
注射用双连翘是由板蓝根、金银花、连翘等三味中药按一定比例经系统工艺制备而成的兽用粉针剂。本研究观察了注射用双连翘对CEF细胞生长及其抗新城疫病毒感染的影响，旨在探讨注射用双连翘的药理作用，为临床应用提供理论依据。
1、材料与方法
1·1试验药品
注射用双连翘，主要成分为板蓝根、金银花、连翘等按一定比例经系统工艺配制而成，由四川华西动物药业有限公司提供。根据对CEF细胞安全浓度的测定结果[1]，用细胞维持液分别稀释成高、次高、中、次低、低5种浓度（见结果中各表，均以净含量表示），常规消毒后备用。
1·2病毒
新城疫IV系疫苗病毒（NDV，LaSota），四川绵阳宝莱生物药业有限公司提供。经9日龄SPF鸡胚传代2次，按Reed-Muench法测定CEF细胞半数组织培养感染剂量（TCID50），用细胞维持液配成100 TCID50浓度备用。
1·3主要试剂
MEM培养基，Gibco公司产品。按说明书配制，加入犊牛血清，5%为细胞生长液、2%为细胞维持液，再常规量加入谷酰胺和双抗。胰蛋白酶，用PBS溶液配制成0.25%的浓度，调节PH值至7.4，0.22um混合纤维素酯微孔滤膜过滤除菌，分装后-20℃保存备用。中性红，上海试剂三厂生产，用153mmol/L的NaCL溶液配制成含中性红0.5mg/ml的溶液。
1·4试验方法
按文献[2]方法制备CEF细胞，将细胞数调整至5×105个/ml，后加入到96孔细胞培养板中，每孔100ul；37℃、5%CO2条件下培养36h、CEF细胞已长成致密单层后，倒掉孔内液体，用维持液洗3次，最后倒掉维持液，开始分组和处理。
一块细胞板，设立病毒-注射用双连翘组和注射用双连翘组各20孔（5种浓度×4孔/浓度），另设病毒对照组、细胞对照组各4孔和无细胞孔1孔（只加营养液，作为测定时空白调零孔）。首先在病毒-注射用双连翘组和病毒对照组每孔加入100TCID50病毒液100ul，其它组加入100ul细胞维持液，培养12小时后倒掉孔内液体。病毒-注射用双连翘组和注射用双连翘组每孔加入100ul细胞维持液，继续培养。于病毒接种72h后测定CEF细胞活性。
1.5CEF细胞活性测定
采用中性红染料吸收法[3]。测定前2h每孔加入50uL中性红活染液；测定时倒掉孔内液体，用PBS冲洗细胞3次，每孔加入200uL脱色液，置微孔板振荡器振荡10min；然后在酶联免疫检测仪上测定570nm下的吸光（OD）值，作为细胞活性的指标。
分别统计比较病毒－注射用双连翘组与病毒对照组和同浓度注射用双连翘组、注射用双连翘组和细胞对照组OD值的差异性，以评价注射用双连翘对病毒感染细胞能力和CEF细胞生长的影响。
2结果与分析
注射用双连翘的测定结果见下表。病毒－注射用双连翘组OD值均大于、中浓度组显著大于、高、次高和次低浓度组极显著大于病毒对照组（P﹤0.01），除次高浓度组外其他各组与同浓度中药组差异均不显著；注射用双连翘组除低浓度组外均大于细胞对照组。说明注射用双连翘有较强的抑制病毒感染作用和微弱的促细胞生长作用，基本与浓度呈正相关。
注射用双连翘的测定结果
浓度/ug.mL-1 | 病毒－注射用双连翘组 | 注射用双连翘组 |
300 | 0.383±0.006a | 0.383±0.061a |
150 | 0.390±0.028a* | 0.378±0.029a |
120 | 0.350±0.046a | 0.375±0.037a |
80 | 0.378±0.079a | 0.365±0.029a |
40 | 0.335±0.060ba | 0.343±0.019a |
病毒对照 | 0.276±0.054b | |
细胞对照 | 0.363±0.027a |
3小结与讨论
3.1 注射用双连翘对单层CEF生长有不同的影响
中性红染料吸收法的原理是活细胞能够吸收中性红。中性红是一种弱阳离子染料，能与活细胞浆中的阴离子结合而浓缩于活细胞中，并不被细胞洗涤液洗脱，渗入活细胞的中性红量与活细胞数量成正比。因此OD值直接反映活细胞的数量，与细胞增殖的程度成正比[3]。试验结果显示，注射用双连翘组的OD值有的稍大于、有的稍小于细胞对照组，表明注射用双连翘对单层CEF生长无显著影响。 3.2 注射用双连翘显著抑制病毒感染
OD值与细胞的病变程度成反比，间接地反映病毒感染细胞的程度。当细胞被病毒感染破坏或被干扰了功能以后，可降低对中性红的吸收能力，随着病毒爱细胞内不断生长，细胞受到损坏，病变程度逐渐加重，受损细胞数量逐渐增多，OD值降低[4]。结果显示，注射用双连翘5个浓度病毒－注射用双连翘组的OD值显著大于病毒对照组。表明注射用双连翘有较强的抑制病毒感染作用。
中药成分既可通过直接杀灭病毒来保护细胞，也可通过促进细胞生长来抑制病毒的感染。注射用双连翘主要表现抑制病毒感染作用，对细胞生长无明显影响。
在量效方面，注射用双连翘的作用与剂量呈正相关，浓度越高抑制病毒感染作用越强。这些说明注射用双连翘必须有合适的剂量才能发挥最佳效应。
张国红 杜国清 汪勇 熊剑（四川华西动物药品研究所，绵阳高新区，621000）
何晓媛 苏志华 王蓉（四川华西动物药业有限公司，绵阳梓潼，622150）
参考文献
(1)刘家国，胡元亮，陈玉库等：几种天然药物成分在体外CEF中最大安全浓度的测定。 动物医学进展，2002，23（3）：88—91.
(2)殷震，刘景华主编： 动物病毒学（ 第2版）。北京：科学出版社，1997，204-246。
(3)闻平，何艳，叶庆林等：中性红比色法检测细胞增殖活性。镇江医学院学报，2000，10（1）：161—163。
(4)高英杰，贺玉琢，沈鸿等：中性红染料吸收法在抗病毒药物研究中的应用。中药药理玉临床，1998，14（4）：45—47。