大肠埃希菌热敏性肠毒素B亚基研究进展

摘　要： 产肠毒素大肠埃希菌(Enterotoxigenic E.coil，ETEC)是引起幼畜、婴幼儿及旅游者腹泻的重要病原之一。ETEC产生两类肠毒素，一种是对热敏感的热敏性肠毒素(heat­labileenterotoxin， LT)，另一种是对热不敏感的耐热性肠毒素(heat­stable enterotoxin，ST)。LT不仅是ETEC主要的毒力因子，而且还是一种重要的黏膜佐剂，它由A、B亚基组成，由于LTA具有毒性作用，限制了LT作为黏膜免疫佐剂的应用；而LT B无毒且具有黏膜佐剂活性，使其成为备受关注的佐剂之一。近年来对LTB的结构、介导的免疫调节分子机制、突变体及其佐剂作用已进行了较为深入的研究，为充分利用LT B的黏膜免疫佐剂功能奠定了基础。

关键词：大肠埃希菌热敏性肠毒素B亚基；免疫机制；免疫原性；佐剂作用

大多数通过黏膜途径免疫的可溶性蛋白免疫原性都很弱，而且通过口服或滴鼻免疫还可能引起特异性免疫耐受，因此，在黏膜免疫中使用合适的佐剂成为提高免疫原性和降低免疫耐受的主要手段。生物佐剂种类很多，大肠埃希菌热敏性肠毒素是比较有发展前景的佐剂之一。LT为产肠毒性大肠埃希菌分泌到胞周质的一种热不稳定外毒素，是由具有ADP­核糖基转移酶活性的A亚单位以及与神经节苷脂结合的B亚单位组成的AB5型六聚体蛋白，A亚基是其毒性主要单位，B亚基具有免疫原性和佐剂功能。LT不仅具有免疫原性，而且是一种有效的黏膜佐剂，能明显增强机体针对共免疫抗原的IgA和IgG反应，同时还能消除机体对这些共免疫抗原的耐受性，诱发针对它们的长期记忆，因此LT作为黏膜佐剂得到了广泛关注。LT作为佐剂的方式有两种，一种是通过改变毒力位点氨基酸以降低LTA亚基毒性，另一种是单独使用B亚基作为佐剂，以避免A亚基的毒性作用[1­3]。

1　LT B的结构

LT B是由5个分子质量为11.5ku的B亚基单体组成，每个单体与相邻2个单体形成近30个氢键及6个盐桥[4]。这一结构特点使得它在强酸或强碱(pH2.0～11.0)条件下仍然能保持LT B四级结构的稳定，但在极高的酸性条件下，B亚基的五聚体会被解聚成单体(LTB1)，在适当的中性缓冲液中又能重聚。体外模型试验发现单克隆抗体与LT B1以1∶1的比例混合，有50%的LT B1能重聚。如果以2∶1的比例混合只有10%能重聚[5] 。Cheesman C等[6]研究发现，解聚的LTB在KCl­HCl缓冲液中孵育，有80%的单体被重聚。在酸性条件下，随着孵育时间的延长，重聚的单体B亚基将会减少到20%。同时也表明，在解聚的条件下，离子类型对B亚基的重聚有很大的影响。LTB1氨基端的十肽与单抗LDS47有很高的特异性，单抗LDS16对LTB也有极强的特异性结合能力，因此推断出氨基端的十肽区域(APQSITELCS)对B亚基五聚体的形成和稳定很关键[7]。LT操纵子含有2个基因，编码A亚基的toxA和编码B亚基的toxB基因，它们串连在一起被转录成一条mRNA链。toxB基因始于toxA基因3′末端，toxB编码区全长372bp，编码由124个氨基酸组成的肽链。toxB在起始密码子前3个核苷酸处有SD序列，其中5个核苷酸可与16 S 核糖体RNA3′端12个核苷酸中的5个互补，且近ATG端碱基为A。这些结构有助于提高核糖体的结合效率，且toxB mRNA的二级结构也有助于toxB的翻译，从而导致在1个启动子下游，虽然toxB位于远端，但表达量却超过toxA 的5倍。

B亚单位由两个α螺旋和6个β片层结构组成，其N端的一个半胱氨基残基与C端的一个半胱氨基残基形成二硫键，将两个分子末端连接在一起且五个分子排列在一起呈环状结构[8]。LTB主要与GM1结合，也能与GD1b、乳糖酶基(神经)鞘氨醇、一些糖蛋白等结合，但是结合能力相对弱一些[9]。

2　LT B介导的免疫调节机制

LT B调节免疫反应的作用是通过与细胞表面分子结合，从而调节免疫细胞功能。LT B不仅激活B细胞、抗原递呈细胞，而且能诱导CD8＋T细胞选择性凋亡[10] 。

LT B能够上调B细胞表面MHCⅡ类分子、CD25、CD40、B7分子和细胞间黏附分子(ICAM)的表达。利用特异性抑制剂对信号通路的研究发现，这一过程涉及到MAP(mitogen­activatedprotein)激酶的激活，并依赖于MEK激酶(MAPK/Erkkinase)、PI3激酶(PI3­kinase)及蛋白激酶C(protein kinaseC，PKC)。其中PI3激酶不仅对MAP激酶的激活、Erk的激活以及对Erk1/2的磷酸化起关键作用，而且对MHCⅡ类分子、CD25的上调也至关重要。MEK抑制剂只是部分抑制LTB上调MHCⅡ类分子的表达，对CD25的表达无任何影响。但是PKC抑制剂能完全阻断LTB对CD25的上调。CD25的启动子包含NF­κBDNA结合位点，同时也显示转录因子NF­κB诱导BCR的激活依赖PI3激酶和PKC[10­11]。

LT B对CD8＋ T细胞、CD4＋ T细胞的影响不同，它诱导CD8＋ T细胞发生凋亡，但对CD4＋T细胞没有影响。这种凋亡依赖于转录因子NF­κB、c­myc，同时伴随着caspase­3的激活，其对线粒体的损伤可导致细胞色素C的释放以及caspase­9的激活，但凋亡过程不依赖于Fas以及p55TN­FR[4,12]，而且LT B诱导DNA和PARP的降解，caspase抑制剂能抑制此过程。 MarcoSoriani等研究了c­myc对CD8＋ T和CD4＋ T的影响，在LT B诱导的CD8＋ T细胞凋亡中引入促进细胞增殖基因c­myc，加入LT B大约2 h～4 h之后，上调了c­myc mRNA 和蛋白的表达。但是LTB不能激活CD4＋ T细胞中的c­myc，这些T细胞能抵抗LT B 引发的细胞凋亡[9,12­13]。但使用反义寡核苷酸(AS­ODNs)后导致myc蛋白的翻译部分被阻滞，此过程能很大程度抑制LT B诱导的CD8＋T细胞凋亡。抑制NF­κB定位的渗透性多肽SN50(核转录因子κB的特异性抑制剂)以及能阻滞IκBα降解和NF­κB细胞核内定位的抑制剂N­对甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲基酮(N­tosyl­l­phenylalaninechloromethyl ketone，TPCK)能够阻滞myc表达和LT B处理的CD8＋ T细胞凋亡。

LTB诱导两个独特的信号途径：①NF­κB/caspase­dependent途径导致细胞核的降解和凋亡；②通过激活一氧化氮合酶(nitricoxide synthase，NOS)调节caspase­independent 途径引起线粒体的功能障碍[10]。 LTB还能够刺激单核细胞分泌高水平的IL­10、IL­6、TNF­a，并抑制IL­12的产生。将LTB刺激过的单核细胞作为混合淋巴细胞反应(MLR)的抗原递呈细胞时，相对于未刺激过的单核细胞，明显提高IL­10、INF­a的产生水平，而细胞增殖水平没有明显的变化[1,10­13]。

3　LT B亚基突变体的研究

对于B亚基突变体的研究，主要是33、57位点的突变。突变体LT B(H57S)、LTB(G33D)分别是在57位点His突变为Ser和33位点Gly突变为Asp。LT B(H57S)与LTB一样，能与GM1结合，与细胞吸附及其转运功能仍然完整。但是LT B(G33D)与GM1没有结合能力。LTB(G33D)经SDS分析其迁移速率比LT B 和LT B(H57S)稍微慢一点。可能是因为突变体LTB(G33D)有带负电荷的Asp残基。但是单聚体LT B(G33D) 、LT B(H57S)的迁移速率一样。LT B、LTB(G33D)、LT B(H57S)在低pH条件下都很稳定。突变体LT B(H57S)与LTB相比在诱导细胞信号方面存在许多的缺陷：①不能引起caspase­3调节的CD8＋ T细胞的凋亡；②不能激活JurkatT细胞中NF­κB的核转运；③对小鼠不能引起有效的抗B亚基免疫反应；④不能作为黏膜免疫佐剂[12]。

93位脯氨酸突变体P93G、P93A 与天然的LTB相比，生物、生化特性改变很少，在五聚体解聚后的再组装能力方面存在很大的差异[14]。

4　LT B免疫原性研究

LTB含有引起LT特异性抗体应答的大部分优势抗原表位，它能有效启动机体产生局部和全身的免疫应答，还能使T、B细胞产生长期的记忆反应。RichardA等在LT B抗原位点研究中，选取了部分LTB前体蛋白的氨基酸片段，发现B亚基单位末端区域的多肽免疫原性较高，58～83氨基酸位点是主要抗原位点。TakahashiI等的研究表明，天然LT引起的黏膜免疫反应主要与LTB85­91氨基酸位点相关，而重组LTB的免疫反应位点主要在36～44氨基酸位点。研究进一步表明，重组LTB的33～45氨基酸位点同时具有T细胞和B细胞表位，机体经LTB26­45多肽段免疫会诱发产生Th1和Th2型细胞因子，同时引发黏膜IgA和血浆IgG的抗体应答反应。

LT B亚单位具有良好的免疫原性，因此可作为免疫原性差的小分子的载体。石振华等[15]将经点突变的STⅠ基因与LTB基因融合，表达的融合蛋白能够诱发小鼠产生抗体，该抗体具有中和天然STⅠ肠毒素毒性的作用。Clements等用基因融合的方法把STⅠ的结构基因片段(Ser54­Va172)连在LTB全基因的下游，并使之处于同一阅读框架中，构建出3种不同的LTB­STⅠ融合基因。经ELISA检测表明，该融合基因能同时表达STⅠ和LT B两种肠毒素。当LTB和STⅠ之间插入7个氨基酸时，STⅠ的表达水平最高，当两者之间有3个氨基酸时，STⅠ表达水平次之。当两者之间不插入氨基酸时，ELISA没有检测到STⅠ的存在。Aitken等将编码STⅠ前体蛋白(pre­STⅠ)的基因片段与LTB基因的3′末端相融合，所产生的LTB­pre­STⅠ融合蛋白具有较好的免疫原性，而且丧失了STⅠ的生物毒素活性。这种重组菌株较好地解决了STⅠ的免疫原性问题，并且去除了STⅠ的毒性。许崇波等[16]将STⅠ毒素活性部位的第4位氨基酸突变(Cys→Ser)，STⅠ突变基因与LTB基因融合，并置于T7启动子下进行共表达，结果STⅠ、LTB均获得成功表达，且能够诱导乳鼠产生抗STⅠ的抗体。而构建的含有K88ac­ST1­LT B融合基因的重组菌株在保留了K88ac和LTB的抗原性的基础上，也检测到了ST的抗原性。Clements等将ST的5′端与LT B3′融合，融合多肽经亲和色谱法纯化后免疫动物，无毒性，且产生的抗体能被LT和ST识别。

Beyer A J等[17]利用转基因玉米表达的LTB，不仅具有免疫原性，而且能诱导IgA抗体分泌。小鼠免疫后能抵抗全毒素LT的攻击。Moravec T等[18]以大豆表达载体表达LTB，经口服免疫小鼠能诱导全身IgG 和IgA以及黏膜IgA反应，表明大豆是口服疫苗有效的生产平台。Rezaee MA等[19]将编码LTB的基因克隆到穿梭载体pYES2上，构建表达载体pLTB83，重组载体转化到啤酒酵母菌中通过半乳糖诱导表达。表达的LTB蛋白与来自细菌的LT B蛋白的抗原性没有差别，重组蛋白免疫的动物能够抵抗ETEC的侵袭，证明表达的LT B有极好的抗原性。KangT J等[20]将猪流行性腹泻中和抗原表位和LT B融合在转基因烟草中表达，经Westernblot检测，融合蛋白的两种成分都能被检测到，且它们能与GM1结合，表明融合蛋白保留天然的抗原性，同时LT B增强了抗原的免疫功效。

5　LT B佐剂作用研究

LT B和霍乱菌素B亚基(CTB)具有相似的免疫原性和免疫调制作用，许多研究都表明它们能引起强的抗毒素反应以及与抗原联合使用能增强免疫反应。而且LT B比CTB更有优势，即LT B能够调节与自身免疫性疾病(关节炎、糖尿病、多发性硬化症等)有关的Th1型反应[12,21]。

Christal C等通过构建LT亚基与霍乱菌素(CT)亚基杂合体(CTA­LT B和LTA­CTB)，发现这些杂合体的毒性和酶活性都有所降低，但仍保持野生型LT的佐剂活性，杂合体与抗原一起联合免疫能引起全身免疫和细胞免疫。ApostolakiM等[1]使用卵清蛋白(OVA)与LTB滴鼻免疫小鼠，能增强T细胞的分化和全身免疫反应，也增强了针对OVA的特异性IgG1的产生。同时他们使用Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV­1)糖蛋白与LTB经鼻免疫小鼠，可增强细胞的分化和细胞因子的产生，而且反复免疫的也不会引起小鼠炎症反应。LT和LTB作为佐剂，低剂量的LT和高剂量的LT B混合，能刺激非常高的特异性IgG的产生。RichardWeltzin等用尿素酶经注射途径免疫小鼠，同时将尿素酶分别与LT、LT B、LT­LTB混合免疫小鼠，比较后发现，与LT混合免疫主要提高了IgG1的产生，与LT B、LT­LT B混合主要提高了IgG2a的产生。WANGJ等[22]使用人乳头瘤病毒16­L1 DNA疫苗与LTB共免疫，血清中检测到高水平的特异性IgG、IgA以及一些细胞因子，更重要是在阴道黏膜也产生了特异的SIgA，为阻止该病毒由黏膜途径感染提供了保障，也减少了此种疾病的发生概率。

Verwei W R等以LT B与亚单位流感疫苗一起经鼻免疫动物，能刺激全身IgG和局部SIgA的分泌。Tamura S等将LTB和LT混合与流感病毒通过滴鼻免疫小鼠，免疫后小鼠能够抵抗流感病毒PR8的攻击。同时也发现LTB和LT对于人的流感病毒疫苗也是一类很有效的佐剂。 Haan等研究表明，LTB和流感病毒经鼻免疫小鼠，不仅能刺激全身免疫反应，而且能引起局部抗体反应。Hashigucci等使用三价灭活疫苗与佐剂LT B一起经鼻免疫小鼠，不仅能提高IgG水平，而且也能提高IgA的水平。Fingerut E等[23]用LTB和BSA混合分别经肌肉、皮下、口服三种途径免疫小鼠，结果发现LTB经皮下、口服途径免疫组抗体水平有明显的提高，但是肌肉注射组抗体水平没有任何的变化。YamanakaH等[24]使用牛朊病毒蛋白和鼠朊病毒蛋白分别与LT B融合后免疫小鼠，牛朊病毒蛋白与LTB融合组产生的血清特异性的IgG和IgA明显高于非融合组，而鼠朊病毒蛋白与LTB融合免疫组的相比，抗体水平提高得很少。该研究表明朊病毒蛋白与LT B融合有可能成为经黏膜途径免疫朊病毒疫苗的一种新方法。WangJ等[25]以禽卵溶菌酶蛋白(HEL)与LT B一起经滴鼻免疫小鼠，结果表明，与LTB共免疫组抗HEL特异性IgG和IgA显著高于单独使用HEL组，证明LTB是一种很有效的黏膜佐剂，可有效提高免疫原全身和黏膜免疫反应。

大量研究表明，LT B不仅具有免疫原性，而且无毒，是一种非常理想的黏膜佐剂，能满足人们对疫苗制剂的有效性和安全性的要求。目前以LTB作为黏膜佐剂的产品已走向商品化，为LT B黏膜佐剂的临床应用展示了良好的前景。