摘 要：为了进一步研究蒙药对奶牛乳房炎两种主要病原菌的体外抑菌和体内抗菌作用，用牛津杯法测定了15味蒙药对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌抑菌圈直径，用二倍稀释法测定了3种蒙方在体外的最低抑菌浓度(minimalinhibitory concentration，MIC)和最低杀菌浓度(minimal bactericidalconcentration，MBC)。又以大肠埃希菌感染小鼠，经口灌服蒙方以判断其体内抗菌效果。有8味蒙药对两种菌有较好的抑菌作用，抑菌环直径均大于12mm，最大达到22 mm。3种蒙方体外有较好的抑菌作用，其中方Ⅱ对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌抑制作用最强，MIC分别为0.125g/mL和0.25 g/mL，MBC均为0.25 g/mL。口服不同剂量方Ⅰ的感染小鼠生存率明显高于阴性对照组。
关键词：蒙药；抑菌性；小鼠；存活率
蒙药是一种纯天然药物，含有多种生物有效成分，具有抗菌消炎等作用，保持机体内环境的动态平衡，以达到防治疾病的目的[13]。
奶牛乳房炎是一种常见病和多发病，引起奶牛乳房炎的病因有多种，但主要是由触染性病原和环境性病原引起[4]。触染性病原包括无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌和支原体等。环境性病原微生物主要包括大肠埃希菌、乳房链球菌、肺炎克雷伯菌和产气杆菌等。大肠埃希菌来源于牛粪及其污染的环境，从损伤的生殖道进入血液或淋巴而引起感染，严重的可引起乳房坏疽，临床症状明显，乳房肿胀、发热，食欲废绝，并伴有胃肠道症状，乳汁水样黄色，泌乳量急剧下降[56]。
本研究选用15味常用的蒙药和3种蒙方，对呼和浩特某奶牛场粪中分离出的大肠埃希菌O8和金黄色葡萄球菌进行体外抑菌试验和体内抗菌试验，为该蒙药的进一步研究奠定基础，也为研发治疗奶牛乳房炎的蒙药制剂提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 药物 格秀讷(大黄)、协日嘎(姜黄)、巴如拉(川楝子)、阿茹拉(诃子)、珠如拉(栀子)、协日毛敦道日素(黄柏)、洪连 (胡黄连)、额热阿拉坦呼胡尔(雄黄)、黑苏嘎(石决明)、查那其其格 (赤芍)、协日洪连 (黄连)、达希勒(乳香)、希和日乌布斯(甘草)、吉吉格诺格图茹乌布斯(川贝)、浑钦(黄芩)等均购自呼市九龄大药房。
方Ⅰ：格秀讷、协日嘎、巴如拉等8味药组成。
方Ⅱ：阿茹拉为主药，配合其他药物。
方Ⅲ：额热阿拉坦呼胡尔为主药，配合其他药物。
1.1.2 菌种 大肠埃希菌O8为内蒙古农业大学动物科学与医学学院从呼和浩特市某奶牛场牛粪便中分离，鉴定为致病性的强毒株，金黄色葡萄球菌是从牛乳中分离，由内蒙古农业大学动科学与医学学院微生物教研室提供。
1.1.3 实验动物 60只昆明系小鼠，雌雄各半，体重18 g～21 g，由内蒙古大学实验动物中心提供。
1.2 方法
1.2.1 抑菌圈直径的测定 用牛津杯法测定单味药的抑菌圈直径。
1.2.1.1 菌液制备 将试验菌分别接种于肉汤培养基于37 ℃放置18h后，以倾注平板法培养计数，用灭菌生理盐水稀释到含菌数为106个/mL备用。
1.2.1.2 药液制备 采取水浸、水煎浓缩方法，将所有单味药和复方制成生药含量2 g/mL，各备1份。
1.2.1.3 平皿的制备 取内径90 mm，高16 mm～17 mm的平皿。分别注入加热融化的培养基 20mL作为底层，使其在皿底内均匀摊布，并放置于水平台上使凝固。另取培养基适量加热融化后，放冷至48 ℃～50℃，加入规定的试验菌悬液适量摇匀，在每平皿中分别加入5mL，使在底层中均匀摊布，作为菌层。放置水平台上冷却后，无菌条件下，用牛津杯放置器将牛津杯(内径6.0 mm±0.1 mm，高10.0mm±0.1 mm，外径8.0 mm±0.1 mm的不锈钢小杯)放入培养基中，分别加入100μL的蒙药药液于牛津杯内，编号标记，用陶瓦圆盖覆盖，37 ℃培养24h，用游标卡尺测量抑菌直径，每种药重复试验5次，取平均值。当直径在10 mm～15 mm之间为敏感，大于15 mm为高敏感[7]。
1.2.1.4 最小抑菌浓度(MIC)的测定 以无菌营养肉汤倍比稀释3种方药，使药液浓度分别为1、0.5、0.25、0.125、0.0625 g/mL(同时无药液肉汤为阳性对照组，不加菌液的肉汤为阴性对照)。各试管中分别加入上述制备的菌液50 μL，摇匀；37 ℃培养24h，以不显示浊度细菌为生长时药物浓度作为MIC[7]。
1.2.1.5 最低杀菌浓度(MBC)的测定 测出最低抑菌浓度(MIC)后，再依次从未见细菌生长的各试管培养物中分别吸取0.05mL，接种于不含药的平皿琼脂培养基上，轻轻摊开菌液，37 ℃培养24h。观察有无细菌生长。生长的菌落数小于5个菌落的药液最低浓度，即为最低杀菌浓度(MBC)[89]。
1.3 体内抑菌试验
1.3.1 细菌悬液的制备 根据预试验将试验菌分别接种于肉汤培养基，37 ℃放置18h后，以倾注平板法培养计数，用生理盐水稀释到含大肠埃希菌菌数为1.0×1012个/mL备用[6]。
1.3.2 试验分组及处理 体重18 g～20 g小鼠60只，按体重随机均分成6组，每组10只。分别为试验Ⅰ组：灌胃方Ⅰ120mg/kg剂量；试验组Ⅱ：灌胃方Ⅰ60 mg/kg剂量；试验组Ⅲ：灌胃方Ⅰ30 mg/kg剂量；试验组Ⅳ：灌胃方Ⅰ15mg/kg剂量；阳性对照组，灌服0.6%环丙沙星药液按体重0.1 mL/10 g；阴性对照组，灌服灭菌自来水0.1 mL/10g。各组小鼠在感染菌液之前每天灌胃2次，连续7 d，末次给药1h后给每只小鼠腹腔注射1.0×1012个/mL浓度的大肠埃希菌菌液0.5 mL，观察感染后5 d内各组小鼠的生存情况。
2 结果
2.1 单味药物抑菌试验结果
试验结果见表1。
表1 8味药抑菌圈直径平均值
Table 1 The bacteriostasis area diameter of 8 kinds of singleherbal medicinemm
药物 Medicine | 大肠埃希菌 Escherichiacoli | 金黄色葡萄球菌 Staphylococcusaureus |
协日洪连 Huang lian | 12.86±1.13 | 22.38±1.10 |
协日毛敦道日素 Huang bai | 14.00±1.06 | 19.48±1.14 |
阿茹拉 He zi | 16.28±1.62 | 14.24±1.11 |
希和日乌布斯 Gan cao | 12.56±1.15 | 14.54±1.31 |
洪连 Hu huang lian | 12.98±1.13 | 12.86±1.43 |
查那其其格 Chi shao | 12.66±1.20 | 15.20±1.03 |
格秀讷 Dai huang | 14.72±0.85 | 17.06±1.49 |
浑钦 Huang qin | 16.20±1.35 | 14.02±0.95 |
2.2 最小浓度抑菌浓度和最小杀菌浓度
由表2可知，方Ⅰ对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的最小浓度抑菌浓度(MIC)均为0.25 g/mL，最小杀菌浓度(MBC)均为0.5g/mL；方Ⅱ对大肠埃希菌MIC为0.125 g/mL，MBC为0.25 g/mL，对金黄色葡萄球菌的MIC和MBC均为0.25g/mL；方Ⅲ对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的MIC和MBC均为1 g/mL。
表2 3种蒙方对2种菌的MIC及MBC
Table 2 The MIC and MBC of 3 kinds of prescription medicine against2 kinds of bacteriag/mL
药物 Medicaments | 大肠埃希菌 Escherichiacoli | 金黄色葡萄球菌 Staphylococcusaureus | ||
MIC | MBC | MIC | MBC | |
方Ⅰ Prescriptionmedicine Ⅰ | 0.25 | 0.5 | 0.25 | 0.5 |
方Ⅱ Prescription medicine Ⅱ | 0.125 | 0.25 | 0.25 | 0.25 |
方Ⅲ Prescription medicine Ⅲ | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
由表3可知，试验组除了15mg/kg剂量组外，其余各组与阴性对照组之间均有显著差异(P<0.05)，表明方Ⅰ按120、60、30mg/kg的剂量给小鼠灌服，对大肠埃希菌感染的小鼠有显著的保护作用(P<0.05)，且与0.6%的环丙沙星药效相当(P＞0.05)。
表3 感染大肠埃希菌后小鼠生存情况
Table 3 Survival status of mice after infected Escherichia coli
2.3 体内抗菌试验结果
由表3可知，试验组除了15mg/kg剂量组外，其余各组与阴性对照组之间均有显著差异(P<0.05)，表明方Ⅰ按120、60、30mg/kg的剂量给小鼠灌服，对大肠埃希菌感染的小鼠有显著的保护作用(P<0.05)，且与0.6%的环丙沙星药效相当(P＞0.05)。
表3 感染大肠埃希菌后小鼠生存情况
Table 3 Survival status of mice after infected Escherichia coli
组别 Groups | 试验用小鼠/n Mice for test | 存活数/n Survival numbers |
试验组Ⅰ Treatment group Ⅰ | 10 | 10 |
试验组Ⅱ Treatment group Ⅱ | 10 | 8 |
试验组Ⅲ Treatment group Ⅲ | 10 | 5 |
试验组Ⅳ Treatment group Ⅳ | 10 | 2 |
阳性对照组 Positive control group | 10 | 9 |
阴性对照组 Negative control group | 10 | 2 |
由供试15味蒙药的体外药抑菌结果可知，按其抑菌效果排在前8位的有协日洪连、协日毛敦道日素、阿茹拉、希和日乌布斯、洪连、查那其其格、格秀讷、浑钦，这8味蒙药对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的抑菌作用显著，平均抑菌圈直径大于12mm，最大达到22 mm。
蒙方是利用了药物的互相协同、颉颃的作用，使其充分发挥药物的疗效。受试的3种蒙方在体外对金色葡萄球菌和大肠埃希菌有抑制作用。方Ⅰ以格秀讷为主要药物，对大肠埃希菌的MIC、MBC分别为0.25g/mL和0.5 g/mL。方Ⅱ以阿茹拉为主要药物，对大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌有效的抑制作用，MIC分别为0.125g/mL和0.25 g/mL。MBC均为0.25g/mL。方Ⅲ以额热阿拉坦呼胡尔为主要药物，对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的MIC均为1.0 g/mL，MBC均为1.0g/mL以上。在3个蒙方中，方Ⅱ的体外抑菌效果最好。
蒙方Ⅲ体外抑菌作用比较差，方Ⅱ体外抑菌效果虽好，但是考虑到用于生产中成本太高，因此选用方Ⅰ做试验。方Ⅰ是依据蒙兽医理论配制的复方蒙药，体外抑菌作用与动物体内抗菌作用结果不一致，经口服灌服方Ⅰ后，感染大肠埃希菌的小鼠存活率显著提高。表明方Ⅰ的肠道吸收效果和体内抗菌效果良好，但其体外抑菌作用较差。这可能与药物体内代谢转化，以及抗炎、免疫增强等作用有关[10]。