Fowlicidins及其功能研究

摘　要：Fowlicidins是鸡体内的一类新型的Cathelicidin抗菌肽，其前体分子的氨基端含有一个高度保守的cathelin前片段，而羧基端的氨基酸序列具有特异性。它们有广谱的抗菌活性，具有避免抗菌剂耐药性的潜能，是理想的候选抗菌药物。

关键词：Cathelicidin；Fowlicidin；抗菌活性；重组表达

为了能在含有多种病原菌的复杂生物界生存，植物、无脊椎动物和脊椎动物都已经发展生成特殊的防御机制来抵制和逃避外界微生物的侵害。其中备受关注的一个防御机制就是众多生物机体都可以产生许多特异性的短肽，它们具有广谱的抗菌活性，能在宿主早期防御中起到屏障作用。因而，这些短肽被形象地命名为抗菌肽(antimicrobialpeptides，AMPs)。抗菌肽分子质量相对较小，一般来说，不到100个氨基酸，因富含组胺酸、赖氨酸、精氨酸而带正电，又被称为阳离子宿主防御肽，而且它们是两亲性分子，含有疏水性和亲水性区域。绝大多数抗菌肽是由先天免疫细胞产生的，例如中性粒细胞、吞噬细胞、黏膜上皮细胞和皮肤角质化细胞等[1­3]。

禽体内存在两大家族抗菌肽，即防御素和Cathelicidin，其中以防御素为主[4­10]。防御素又以β防御素为主，可从鸡、火鸡、鸵鸟的血液、鸡与火鸡的白细胞以及企鹅的胃内容物中分离出来。禽β防御素是一类富含精氨素的抗菌肽，其分子内含有由6个保守半胱氨酸残基形成的3对二硫键，具有特殊的稳态结构和广泛的生物活性，有抗G＋和G－细菌、真菌及被膜病毒的作用。现今，关于禽β防御素的抗菌作用机制和生物学特征的报道有很多，而关于禽Cathelicidin的介绍甚少。基于此点，本文重点将介绍Fowlicidins。与所有Cathelicidin一样，Fowlicidins氨基末端都具有一个高度保守的cathelin前片段，而其羧基端的氨基酸序列具有特异性，有着抗菌活性和免疫调节功能。文章首先对Fowlicidins发现历史和组织分布进行简要介绍，在此基础上对禽Fowlicidins的分子生物学特征和抗菌活性及其在生物制药和保健产品上的应用前景作一介绍。

1　Fowlicidins的发现历史和组织分布

2005年，van DijkA等[4]从鸡骨髓细胞中克隆出一种新奇的鸡Cathelicidin——鸡骨髓抗菌肽，命名为CMAP27。随后，XiaoY等[7]从鸡肝脏中克隆出3种鸡Cathelicidins，即Fowlicidin­1、Fowlicidin­2和Fowlicidin­3，其中Fowlicidin­3与CMAP27通过序列比对有100%同源性，应该视为同一抗菌肽。FowlicidinmRNA在鸡骨髓样组织和淋巴样组织有很高的表达，尤其在法氏囊和骨髓中居多，在睾丸、脾、肾、肝和胸腺中有适度的表达[4,10]。Fowlicidins在盲肠扁桃腺中也有很高的表达，但是，Fowlicidins在肠道的其他部位仅有少量表达。上消化道没有Fowlicidins的表达，前胃也只是有微量的Fowlicidins表达，这可能是由于食管的扁桃腺处于食管和前胃的边缘[11]，而食管的扁桃腺与盲肠的扁桃腺一样，被认为是肠相关淋巴样组织的一部分。Fowlicidins在皮肤组织表达量很低，令人惊讶的是，Fowlicidins在尾脂腺中却有极高的表达量。而尾脂腺是一个脂肪性腺体，位于鸟/禽类尾巴底部，鸡形目的尾脂腺相对较大。尾脂腺分泌油脂来维持羽毛状况正常，除水禽类之外，这种油脂可通过尘浴来遍布在整个羽毛上[12]。这类分泌型的腺油脂含有具抗菌特性的烷基代石蜡酸和乙醇，可以为禽类抗感染提供保护作用[13]。鉴于Cathelicidin类抗菌肽在与哺乳动物皮肤相关的先天免疫中发挥重要的效应子作用[1­3,14­15]，或许Fowlicidins对宿主也应该有同样的作用。因此，Fowlicidins短肽与腺油脂一同分泌，遍布全身羽毛和皮肤，推测它们可能对抗皮肤病原菌的先天免疫有重要作用。

2　Fowlicidins的分子生物学特征

2.1　Fowlicidins的分子结构

成熟的鸡Fowlicidins是富含精氨酸的单链分子，氨基酸数量在26～32之间[4,7]。在鸡的3种Fowlicidins中，Fowlicidin­1和Fowlicidin­3具有非常高的相似性，两者的序列上具有大于90%的同一性。这两个具有有效抗菌活性的抗菌肽，在进化上有同源性，或许就是宿主先天防御得以加强的一个表现形式；同时，Fowlicidin­1和Fowlicidin­3仍有一些不相交叉的生物学功能有待去发现。

Fowlicidin­1和Fowlicidin­3在一级结构上具有很高的相似性，它们在模拟的膜环境中具有相似的α螺旋构象[8­9]。此外，在这两种短肽中心螺旋区域附近都有一个铰链(图1)，因为它们都有一个保守的甘氨酸残基存在。但是，有趣的是，对Fowlicidins来说，甘氨酸诱使的铰链并不是独特的，许多α螺旋阳离子宿主防御肽都共有此特征[16­17]。铰链结构的存在已经被证明有助于增强抗菌肽分子的柔韧度，从而减少其他一些刚性抗菌肽对哺乳动物细胞的毒性伤害。

大多数α螺旋阳离子抗菌肽的一个重要特点是两亲性[16­17]。可是，与典型α螺旋抗菌肽不同的是，Fowlicidins的长螺旋有较弱的两亲性，亲水氨基酸残基和疏水氨基酸残基没有明显的分界线。而且，Fowlicidins的α螺旋区域是高度疏水的。如在Fowlicidin­1α螺旋区域中，仅有两个阳离子氨基酸残基(R11和R21)和两个不带电极性氨基酸残基(T12和N18)；在Fowlicidin­3α螺旋区域中，仅有1个阳离子氨基酸残基(K22)和3个不带电极性氨基酸残基(N12，T13和N19)，而其他正电荷氨基酸主要集中在它们的N和C末端[8­9]。

Fowlicidins同样与所有已知的哺乳动物Cathelicidins具有很高的相似性，尤其在前体片段区域最为显著(图2)。值得注意的是，在所有哺乳动物Cathelicidins的cathelin区域中，保守的4个半胱氨酸残基以同样的方式排布在Fowlicidins中。这些特点明确地揭示，Fowlicidins就是非哺乳动物Cathelicidins。更令人惊讶的是，比起典型的Cathelicidins，Fowlicidins与NGP(正常糖蛋白)在信号序列区域反而有较高的相似性(图2)，意味着Fowlicidins和NGP可能有更大的相关性[7]。

虽然Fowlicidins和典型的Cathelicidins在N末端有很高的保守性，但是它们在C末端却有着非常大的差异(图2)。与典型Cathelicidins相似的是，由于过量阳离子残基(Arg和Lys)的存在使得Fowlicidins的C末端带有正电荷。牛和猪弹性蛋白酶加工和释放成熟Cathelicidins时所偏爱的酶切位点[18­19]在鸡体内同样有具有保守性。因此，推测成熟的Fowlicidin­1、Fowlicidin­2、Fowlicidin­3都不含有半胱氨酸残基，分别由26、32和29个氨基酸残基组成，并分别带有＋8，＋10和＋7个净电荷[7]。

A.Fowlicidin­1；B.Fowlicidin­3

图1　Fowlicidins的分子结构

Fig.1　Molecular structure of Fowlicidins

图2　Fowlicidins与典型的哺乳动物Cathelicidins的序列比对

Fig.2　Multiple sequence alignment of chicken Fowlicidins withrepresentative mammalian Cathelicidins

2.2　基因的位置和结构

鸡全基因组编码3个Fowlicidins，这些编码基因位于鸡染色体2p末端约7.5kb处。在染色体上，Fowlicidin­2和Fowlicidin­3基因以头对头的方式紧密排列，两个基因终止密码子间隔736碱基，共占据了染色体7.5kb的基因长度。可是，Fowlicidin­1和Fowlicidin­2之间却被一个大小为2.4ku的基因片段分隔，该片段与编码囊泡相关的类钙调节蛋白激酶基因的羧基端同源(图3)。对比鸡3个Fowlicidins抗菌肽基因片段，可以看出它们之间有相当高的同源性，其中以Fowlicidin­1和Fowlicidin­3之间具有更高的相关性，在全基因序列上有大于90%的同一性[7]。

编码Fowlicidins的3个基因都具有相似的结构，即4个外显子被3个内含子间隔开来，起始的3个外显子编码信号肽和cathelin前片段，而最后的一个外显子主要编码成熟片段[7]。这种基因结构类型与哺乳动物Cathelicidins基因结构类型是完全一致的[2­3]，明确地指示出Cathelicidins基因在生物进化过程中有重要的保守性。从Fowlicidins的起源来看，Fowlicidin­1和Fowlicidin­3的产生很可能是基因复制的结果，因为它们整个开放阅读框有着显著的相似性(图2)，并且它们基因的内含子片段也有很高的相似性。Fowlicidin­2与Fowlicidin­1和Fowlicidin­3相比，在前3个外显子编码的肽片段上同样有着显著的同源性，但是在最后1个外显子编码的肽片段上却有着很大的不同(图2)，或许Fowli­

cidin­2基因是直接从Fowlidicin­1或Fowlicidin­3复制而来的，但不是经过外显子改组而得来的，因而，有爪动物可能借此方式产生了在最后一个外显子上有明显序列趋异的多种Cathelicidins。

图3　Fowlicidins 的基因组结构

Fig.3　Genomic organization of the chicken fowlicidin cluster

3　Fowlicidins的抗菌特性及其作用机制

3.1　Fowlicidins的抗菌特性

各种实验数据表明，Fowlicidins有着强有力的、不依赖盐离子的、广谱的抗菌活性。Fowlicidins的抗菌谱见表1。

表1　Fowlicidins的抗菌谱

Table 1　Antimicrobial spectrum of Fowlicidins

由表1可知，Fowlicidins抑制大肠埃希菌所需的最小药物浓度(MIC)为1.59 μmol/L～2.66μmol/L之间。事实上，SMAP­29是目前所报道的最有效的Cathelicidin抗菌肽[14,18]，可是Fowlicidins与其相比，表现出相当的抗菌特性。当与细菌接触时，Fowlicidins能立即开始杀菌作用，这与人Cathelicidin­LL­37非常不同，LL­37穿透细菌内膜之前需要20min～30min[21­23]。但是，与多数抗菌肽不同的是Fowlicidins抗菌活性不受生理盐浓度的影响，甚至在NaCl浓度为150mmol/L时，仍然保持着抗菌活性，并且对抗性菌株有很强的抑制作用[7]，这意味着Fowlicidins在抗感染治疗应用上有着很大的潜力。

虽然Fowlicidin­1和Fowlicidin­3在结构和抗菌特性上非常相似，但在对哺乳动物细胞毒害上，Fowlicidin­3远低于Fowlicidin­1，Fowlicidin­1的高细胞毒性很可能与其α螺旋柔韧性受到靠近酪氨酸残基的一个侧链的空间位阻作用有关[8­9]，后续的研究或许可以考虑通过增加Fowlicidin­3α螺旋柔韧性来改变其特性。其实，很多文献都曾报道，多数α螺旋抗菌肽铰链区的柔韧性与其细胞毒性负相关[19­20]。因为两亲性、疏水性和螺旋性是影响α螺旋阳离子抗菌肽抗菌性和毒性的重要因素[19­20]，对这些结构及其物理化学上的参数进行适当合理地改变，很可能更进一步地改良Fowlicidin­3的功能特性。另外，Fowlicidins都能非常有效地阻止LPS诱导的炎症基因表达，因而，Fowlicidin­3非常有希望发展成为新一代抗菌和防腐药剂。

3.2　Fowlicidins的抗菌机制

到目前为止，Fowlicidins的准确抗菌机制还没有被确定。普遍认为Fowlicidins是通过在微生物壁膜上形成多聚体孔道而裂解细胞的。为了能在细胞壁内形成孔道，抗菌肽必须满足以下结构要求：①能够结合到微生物壁膜上；②能够在膜壁内形成多聚体；③形成孔道[24­25]。已经发现抗菌肽的阳离子特性和两亲性能使其与细胞膜脂质双分子层结合并相互作用，进而导致细胞内水溶性内容物的外泄。此外，因为多数抗菌肽带正电，能与带负电的磷脂相互作用，这就为抗菌肽与细菌膜壁结合的特异性提供了合理的解释。并且，产生抗菌肽的生物体与抗菌肽作用的靶生物体进化关系越远，抗菌肽与靶生物体间静电相互作用就越强。因此，阳离子抗菌肽优先地结合暴露在外的带负电荷的细菌膜壁，而与存在于哺乳动物细胞质膜外单层的两亲化合物不结合[24­25]。BommineniYR等[9]对Fowlicidins的抗菌机制进行了研究，Fowlicidins是以多聚体的形式作用于微生物膜壁上，并在其上形成膜孔。也可推测Fowlicidins首先以单体或多聚体的形式通过静电作用结合在膜上，然后互相识别形成多聚体并插入到膜的疏水核中并与膜的脂层相互作用形成通道，同时其他单体或小的多聚体继续结合上来使通道的孔径扩大，细菌因而便失去膜势，不能保持正常渗透压而死亡。

显然，不同的抗菌肽采用不同的抗菌机制，并且对于一个特定的抗菌肽其作用模式同样因作用菌种的不同而有所不同[24­25]。因此，进一步探究Fowlicidins的疏水性、带净正电荷量、构象的柔韧度以及二级结构与其抗菌作用之间的相互关系，对揭开Cathelicidins类抗菌肽的作用机制及其在抗感染应用方面都有积极意义。

4　结语

随着对Fowlicidins等相关抗菌肽研究的不断深入，必将开创治疗微生物感染类疾病的新纪元。当今，所使用的抗生素都是微生物的次级代谢产物。由于抗生素的滥用，不可避免地导致耐药微生物的产生，对人类自身生存和发展产生很大的威胁。而解决微生物耐药问题的一个有效途径就是研制出与传统抗生素作用机制不同的新型抗菌药。考虑到Fowlicidins有着强大的、盐不依赖性的、广谱的抗菌活性，在机体免疫中有一定调节作用，而且更为重要的是其抗菌机制完全不同于传统抗生素，通过基因工程方法，利用细胞依赖或无细胞型蛋白表达系统生产重组Fowlicidins抗菌肽将会有重大意义[26]。而且，随着Fowlicidins表达量的不断提高，对其抗菌机制的深入研究、临床抗微生物活性鉴定及在其他药学应用上的评定，都有很大推进作用。