新疆地区蚊类携带西尼罗病毒情况调查研究

摘　要：为查明新疆地区蚊体内携带西尼罗病毒的情况，从2005年－2007年每年的7月～10月采集新疆不同地区的蚊子共计16000余只，并提取总RNA，通过RT­nestPCR的方法检测样品中西尼罗病毒。结果表明，调查样品中没有检测到西尼罗病毒，但不能就此推测新疆是否存在西尼罗病毒，至少对新疆地区和全国制定针对不同动物和人的积极防御政策有重要的公共卫生学意义。

关键词：西尼罗病毒；新疆；蚊子

西尼罗病毒(West Nile virus，WNV)是经库蚊等嗜鸟蚊传播，以鸟类为主要动物宿主的黄病毒，与日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)同属一个病毒组，可致人、马和其他哺乳动物的西尼罗脑炎[1]。病毒基因组是由11 029 个核苷酸组成的单股正链RNA，蛋白包括3种结构蛋白C、prM/ M、E蛋白和7种非结构蛋白[2]。WNV于1937年首次从非洲乌干达西尼罗地区一例发热女患者的血液标本中分离到，主要流行于非洲、中东等地区[3]。但20世纪90年代以后，WNV感染开始流行。WNV的暴发范围和强度明显增加，病情严重，病死率高。目前该病已经分布于整个非洲(南非18、苏丹19、突尼斯20、摩洛哥21)、欧洲(法国22、罗马尼亚23,24、俄罗斯)、中东(以色列25)、亚洲(俄罗斯、印度26)[4]。WNV感染首次在欧洲大规模流在罗马尼亚[4­5]，尤其1999年以来，WNV在美国肆虐，从1999年纽约报告首例美国人感染WNV至2005年6月，全美共报告了19655人感染该病毒的病例，其中782人死亡，除夏威夷和阿拉斯加州外(华盛顿州仅在2002年动物发现有WNV流行外)，各州均报告有西尼罗病例[5]。截至目前我国尚未发现西尼罗热或西尼罗病毒脑炎病例的报道，也未见在我国分离到西尼罗病毒，但是我国存在发生西尼罗传染病的潜在威胁。近年发现我国局部地区人群存在较高西尼罗病毒IgG抗体水平[6]。我国新疆将最有可能是病毒侵入的地区。一是在地理环境上已经被该病毒包围，美国疾病预防控制中心(Centersfor Disease Control andPrevention，CDC)[7]发布的对黄病毒科中的JEV、WNV等在全球的地理分布图上，新疆的大部分地区已经被认为是流行区域。与新疆相邻的俄罗斯、哈萨克斯坦、印度、巴基斯坦等国的部分地区均已发现WNV的存在或WNV的暴发和流行[8]；二是新疆地区存在有WNV传播的主要载体库蚊和其他多种蚊子以及丰富的野生鸟类资源，可以成为WNV在自然界中的扩大宿主，一旦病毒传入，将很快在当地成为一种自然疫源性疾病。

1　材料与方法

1.1　标本来源

2005年7月～10月，2006年7月～10月，2007年7月～10月分别采集了石河子、伊犁、阿勒泰、塔城、乌苏、喀什和阿克苏等7个地区的蚊子(表1)，其中石河子2300余只，伊犁4 500余只，阿勒泰3 000余只，塔城500余只，乌苏2 000余只，喀什2 000余只，阿克苏3000余只，共计16 000余只，其中伊蚊7 000余只，库蚊9 000余只，按采集地区和蚊种不同进行分组，放入液氮中保存。

1.2　标本RNA的制备

将蚊虫标本用无菌生理盐水洗3次，每40只～60只为一组在液氮中研磨，加入1 mL Trizol，将样品在15 ℃～30 ℃放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离，在4 ℃以10 000 r/min离心10 min，取上清，加入0.2mL氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15 s，室温放置3 min。在4 ℃以10 000 r/min离心10min，样品分为3层：黄色的有机相，中间层和上层的水相，RNA主要在水相中，把水相(约600μL)转移到新管中，在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20 min～30 min。在4 ℃以10 000r/min离心10 min，去上清。加入1 mL 750 mL/L乙醇(DEPC处理过的水配制)洗涤沉淀。在4 ℃以5 000r/min离心3 min，倒出液体，注意不要倒出沉淀，剩余的少量液体短暂离心，然后用枪头吸出，注意不要吸出沉淀。室温放置晾干，加入20μL无RNase水，反复吹打混匀，充分溶解RNA。置－70 ℃保存。总RNA电泳图见图1，各泳道28 S和18S条带清晰，二者之间的比大约在2.0，同时可以看到不十分清晰的5 S条带，表明RNA质量可靠。

1～8.不同地区样品

1­8.The samples from different area

图1　从蚊子提取的总RNA电泳图片

Fig.1　The electrophoresis of total RNA extracted from mosquitos

1.3　引物

根据NCBI收录的蚊子的基因序列，设计了蚊子的看家基因引物M1和M2，西尼罗病毒的阳性对照及特异性引物由英国剑桥大学的黎诚耀博士赠送。特异性引物有两对，即WNV1，WNV2，WNV3和WNV4，位于C­preM蛋白区。各引物序列详见表1。

1.4　试剂

Trizol总RNA提取试剂及逆转录试剂盒为宝生物工程(大连)有限公司产品，

1.5　RNA反转录cDNA合成

取RNA 模板1 μL，加入特异性引物下游WNV4,1 μL加入转录反应液(无RNase水0.25 μL，RNA酶抑制剂0.25μL，buffer 5 μL，25 mmol/L硫酸镁2 μL)至反应总体积10 μL；然后，65 ℃ 1 min ,30 ℃ 5min,65 ℃ 25 min,98 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min，逆转录产物(cDNA) 置－20 ℃保存。

1.6　PCR和套式PCR

PCR 反应体系包括一对特异性引物WNV1，WNV4各0.5 μL,25 mmol/L硫酸镁3 μL，灭菌蒸馏水27.75 μL，buffer 8 μL ,1 mmoL/ L dNTPs 5 μL， TaqDNA 聚合酶0.5 μL，逆转录产物10μL至反应总体积50 μL。PCR 扩增先于94 ℃ 3 min；然后94 ℃ 30 s ,58.5 ℃ 30 s,72 ℃ 60s，共40 个循环；最后72 ℃ 5 min。

套式PCR。将第一轮PCR 扩增产物取10 μL 为模板，加入一对内引物WNV2和WNV3进行第2 轮PCR，反应体系与扩增条件同上。PCR产物进行电泳分析，配制含溴化乙锭的18 g/L琼脂糖凝胶，取20 μLPCR产物电泳，在透射式紫外发生仪上观察，并照相记录实验结果(图2)。

2　结果

通过套式RT­PCR检测，对采集蚊虫标本进行扩增，结果均为阴性(表2)。

表1　用于RT­PCR扩增的引物

Table 1　Primers used for RT­PCR assay

1.DNA 标准；2.WNV阳性对照；3.WNV阴性对照；4.蚊子的看家基因；5.看家基因的阴性对照；6～18.不同地区样品

1.DNA Marker；2.WNV positive control；3. WNV negative control； 4.Mosquito house­keeping gene；5.House­keeping gene negative control；6­18.the samples from different area specimens

图2　不同地区蚊子的WNV检测结果

Fig.2　The WNV test results from the mosquitos in different area

表2　蚊虫标本WNV核酸检测结果

Table 2　The test results of mosquito specimens WNV

3　讨论

RT­PCR技术是检测WNV等虫媒病毒的重要手段之一。由于宿主动物、媒介蚊及人群是WNV传播的三个基本环节，因此建立从动物组织、蚊虫标本及人血液或脑脊液等生物学标本中病毒核酸的检测方法是在媒介、宿主及人群中开展WNV感染流行病学调查研究的必要前提。

孙泉云等[9]于2005年从飞抵上海的12种候鸟和4种留鸟中采集208份血清样品，采用酶联光测定法(ELFA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)分别对伯氏疏螺旋体和西尼罗病毒的感染状况进行了血清抗体调查，结果受检野鸟样品的检测结果均为阳性。

佟颖等[10]在北京奥运村、亚运村、工人体育场和顺义奥运水上项目中心外环境、北京饭店室外、故宫、通州台湖稻田、崇文区汽车修理厂、天坛公园花房共设9个采样地点采集蚊子标本，利用VecTest试剂盒和Ramp系统检测WNV，检测结果均为阴性。

军事医学科学院微生物流行病学研究所的张久松[11]在2003年在新疆的伊犁霍城县和阿勒泰北湾地区分别采集蚊子800余只和1100余只，采用套式RT­PCR对样本进行扩增，结果均为阴性。高玉然[12]2005年在新疆伊犁霍城县、新源县、阿勒泰北湾分别采集蚊子900余只、100余只和550余只，采用套式RT­PCR对样本进行扩增，结果均为阴性。

本次实验采集了新疆不同地区的蚊类，样本来源具有广泛代表性，扩大了检测范围并具有较强特异性和敏感性。

本次调查未能在新疆的蚊子标本中检测到WNV，可能与标本的采集范围、蚊种及数量较为局限有关，且标本的远途携带也会影响病毒的检测效果。

这次调查并没有检测到WNV，但是并不能就此推测新疆是否存在WNV，至少对新疆地区和整个国家制定针对不同动物和人的积极防御政策，有重要的公共卫生意义和社会效益。