牛磺胆酸对小鼠胸腺细胞凋亡影响机理的研究

摘　要：探讨牛磺胆酸对小鼠胸腺细胞凋亡影响的机理。采用流式细胞术检测了牛磺胆酸对凋亡过程中磷脂酰丝氨酸外翻的影响；采用分光光度法检测了牛磺胆酸对凋亡特异性蛋白酶Caspase­9、Caspase­3活性变化的影响。结果显示，高剂量牛磺胆酸可显著抑制磷脂酰丝氨酸外翻，抑制细胞凋亡，而低剂量牛磺胆酸则可显著提高caspase­9、caspase­3活性，诱导细胞凋亡。牛磺胆酸对小鼠胸腺细胞早期凋亡呈现抑制作用，而在凋亡中后期则呈凋亡诱导作用。

关键词：牛磺胆酸；胸腺细胞；细胞凋亡；机理

牛磺胆酸(taurocholicacid，TCA)是胆酸的羟基与牛磺酸的氨基以酰胺键结合的一种胆汁酸，是牛羊胆汁中的主要有效成分之一，也是其发挥药理作用的主要成分之一[1]。有研究报道，TCA对动物机体非特异性免疫功能和细胞免疫功能有显著的抑制作用，而对机体的体液免疫功能具有增强作用[2]。细胞凋亡(apoptosis)是多细胞生物生命过程中自稳的一种细胞生理性死亡。与细胞的分裂分化一样，细胞凋亡和机体的正常生长发育以及健康状况有密切的关系，而免疫细胞的凋亡在免疫系统的自稳中甚为重要，已成为当今免疫学研究的一个热点。为了进一步阐明TCA的细胞免疫机理，本文采用流式细胞术、分光光度法就TCA对小鼠胸腺细胞凋亡的影响及其影响机理进行初探，旨在为TCA的临床应用奠定试验基础。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　实验动物　清洁级纯种健康昆明小鼠36只，体重20 g±2 g，雌雄各半，由内蒙古大学实验动物研究中心提供。

1.1.2　药品与试剂　牛磺胆酸，本实验室自制，纯度达97%以上；Caspase­3分光光度法检测试剂盒，南京凯基生物科技发展有限公司，货号KGA­203；Caspase­9分光光度法检测试剂盒，南京凯基生物科技发展有限公司，货号KGA­403；AnnexinV­EGFP细胞凋亡检测试剂盒，南京凯基生物科技发展有限公司，货号KGA­102。

1.1.3　主要仪器　酶标仪(ELX800，BIO­TEKINSTUMENTS)；超净工作台(FLC­3，哈尔滨东联公司)；流式细胞仪(FACSCalibur，美国BD公司)；CO2培养箱(SERIE SⅡ，Forma Scientific，Inc.)。

1.1.4　数据处理　试验结果均以 ±SD表示，采用SAS9.0软件处理数据，两样本比较采用t检验，样本组间差异比较采用F检验。

1.2　方法

1.2.1　给药方法及样品的前处理　取小鼠36只，随机分成3组(每组12只)。第1组为空白对照组，灌胃蒸馏水10 g/kg体重；TCA低剂量组，按0.15 g/kg体重灌胃TCA；TCA高剂量组，按0.25 g/kg体重灌胃TCA。各组连续给药8d，每日1次，末次给药1 h后，眼球放血处死后，750 mL/L酒精浸泡2 min，无菌取胸腺，去除小血管及结缔组织，置于4℃培养液(含RPMI­1640培养基，50 mL/L灭活小牛血清，谷氨酞胺2 mmol/L，青霉素100单位/mL，链霉素0.2mg/mL)中，在250目筛网轻轻研磨， 1 500 r/min离心，4min，再用培养液悬浮，置于玻璃试管中于体积分数为5%的CO2孵育箱中37 ℃培养6 h后刮取胸腺细胞，离心(1 500 r/min，4 min)，收集细胞，调节细胞浓度至2×106/mL备用[3]。

1.2.2　对胸腺细胞早期凋亡的检测　制备胸腺细胞悬液，用Annexinv­PI双染色法和流式细胞仪检测[4](Ex＝488nm；Em＝530nm)3组所有小鼠胸腺细胞凋亡，绿色荧光通过FITC通道，通常为FL2来检测；红色荧光通过PI通道，通常为FL1来检测。将处于不同凋亡时期的细胞区分开，并进一步分别显示出各组小鼠胸腺细胞早期凋亡平均百分率。

1.2.3　Caspase­9的活化程度的检测　分组给药及细胞悬液制备同1.2.1。将分离得到的胸腺细胞用PBS洗涤2次，每次以2000 r/min离心5 min。按照试剂盒要求进行操作。最后用酶标仪在405 nm处测定其吸光值[5]。

1.2.4　Caspase­3的活化程度的检测　分组给药及细胞悬液制备同1.2.1。按照试剂盒要求进行操作。最后用酶标仪在405nm处测定其吸光值[6]。

2　结果

2.1　TCA对胸腺细胞早期凋亡的影响

TCA对小鼠胸腺细胞早期凋亡的影响，检测结果详见表1。

表1　TCA对小鼠胸腺细胞早期凋亡的影响

Table 1　Effects of TCA on inchoate apoptosis of thymocyte

组别 Groups	小鼠数 Number of mice	药品 Drug	剂量/(g·kg－1) Dose	凋亡百分率/% Percentage of apoptosis
空白对照组 Negative control	12	蒸馏水 Distilled water	10	20.41±1.79
低剂量组 Low­dose group	12	TCA	0.15	20.50±1.48
高剂量组 High dose	12	TCA	0.25	16.45±1.41*

注：“*”与阴性对照组相比，差异显著(P<0.05)。

Note：“*”Compare with the negative control group， the difference issignificant(P<0.05).

检测结果显示，高剂量TCA能显著降低凋亡百分率，抑制细胞凋亡，呈免疫增强作用；而低剂量TCA对凋亡百分率则无明显的影响。

2.2　TCA对Caspase­9的活化程度的影响

TCA对小鼠胸腺细胞Caspase­9的活化程度的影响，检测结果详见表2。

表2　TCA对Caspase­9的活化程度的影响

Table 2　Effects of TCA on the activation of Caspase­9

组别 Groups	小鼠数 Number of mice	药品 Drug	剂量/(g·kg－1) Dose	OD值/±SD ODvolum
阴性对照组 Negative control	12	蒸馏水 Distilled water	10	0.266 1±0.028 6
低剂量组 Low­dose group	12	TCA	0.15	0.304 1±0.021 9*
高剂量组 High dose	12	TCA	0.25	0.311 7±0.029 2*

注：“*”与阴性对照组相比，差异显著(P<0.05)。

Note： “*”Compared with the negative control group， the differenceis significant(P<0.05).

检测结果显示，低剂量、高剂量TCA均可显著提高凋亡特异蛋白酶Caspase­9的活性，诱导细胞凋亡，呈免疫抑制作用，但剂量间无显著差异。

2.3　TCA对Caspase­3的活化程度的影响

TCA对Caspase­3的活化程度的影响，检测结果详见表3。

表3　TCA对Caspase­3的活化程度的影响

Table 3　Effects of TCA on the activation of Caspase­3

组别 Groups	小鼠数 Number of mice	药品 Drug	剂量/(g· kg－1) Dose	OD值/±SD ODvolum
阴性对照组 Negative control	12	蒸馏水 Distilled water	10	0.201 1±0.020 3
低剂量组 Low­dose group	12	TCA	0.15	0.238 8±0.027 8*
高剂量组 High dose	12	TCA	0.25	0.217 1±0.016 1

组别 Groups	小鼠数 Number of mice	药品 Drug	剂量/(g· kg－1) Dose	OD值/±SD ODvolum
阴性对照组 Negative control	12	蒸馏水 Distilled water	10	0.201 1±0.020 3
低剂量组 Low­dose group	12	TCA	0.15	0.238 8±0.027 8*
高剂量组 High dose	12	TCA	0.25	0.217 1±0.016 1

注：“*”与阴性对照组相比，差异显著(P<0.05)。

Note：“*”Compared with the negative control group， the difference issignificant(P<0.05).

检测结果表明，低剂量TCA能显著地增加凋亡特异蛋白酶Caspase­3活性，诱导细胞凋亡，呈免疫抑制作用，而高剂量组的则无明显影响。

3　讨论

细胞凋亡(apotosis)是在生理条件下的细胞程序化死亡，是有核细胞在一定条件下通过启动其自身内部机制而实现的。在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸由脂膜内侧翻向外侧[7]，磷脂酰丝氨酸的外露最终改变了细胞表面的生化特性，是凋亡过程中细胞生化特征发生变化的重要指标，也是检测早期细胞凋亡的重要指标之一。由实验结果可知，TCA对早期胸腺细胞凋亡的抑制作用可能与其抑制胸腺细胞中磷脂酰丝氨酸外翻有关。

Caspase是一类半胱氨酸天冬氨酸特异蛋白酶，目前已发现14种，分启动Caspase(如Caspase2、8、9)和效应Caspase(如Caspase3、7)两类，分别参与凋亡的启动和执行过程，它们的活化是凋亡过程中的关键[8]。正常情况下Caspase以无活性酶原形式存在于活细胞，当收到凋亡诱导信号刺激时，通过对其内部门冬氨酸残基位点的蛋白水解而激活，一旦Caspase激活，将引发Caspase级联反应，通过裂解特异性底物及激活内源性核酸酶，使凋亡细胞呈现典型的形态学和生物化学特征[9]。目前，Caspase活化介导的3种凋亡信号传导途径已基本阐明[10]。试验结果表明，TCA可能主要是通过激活Caspase9活化途径，启动Caspase级联反应而诱导胸腺细胞凋亡。

现已明确胸腺细胞可自已发生凋亡[11]，在胸腺细胞自发性凋亡早期时，TCA可抑制其发生凋亡，使胸腺细胞分化增殖，参与免疫反应。但随着免疫反应进行到一定阶段，即胸腺细胞分化增殖到一定数量时，TCA就开始诱导其凋亡，使免疫细胞维持在一定的数量水平，保证免疫反应有序地进行，从而使机体免疫系统保持稳态。由此可知，免疫细胞对凋亡早期和凋亡晚期的反映是截然不同的。本试验结果显示，TCA在胸腺细胞凋亡早期呈抑制作用，而在凋亡后期则呈诱导作用。该结果提示，TCA通过对不同阶段免疫细胞凋亡产生诱导或抑制作用，调节机体的免疫反应。