摘 要：根据GenBank中已发表的枯草芽孢杆菌pgsA的基因序列，设计合成了一对能扩增1 225bp基因片段的引物。以枯草芽孢杆菌染色体DNA为模板，经PCR扩增得到目的片断，然后将其克隆到pMD18-T载体上，经蓝白斑筛选和酶切鉴定选择阳性克隆进行序列测定。经DNAStar软件将其与GenBank上的pgsA序列进行同源性比较，结果表明，核苷酸同源性均在90%以上，氨基酸同源性为94%以上。核苷酸序列系统进化树分析，发现该试验株与浙江株亲缘关系最近。经ProtScale软件分析表明，该基因所编码蛋白在靠近其N端存在一个跨膜区，为跨膜表达体系的建立和新型口服基因工程疫苗的研制奠定了一定的基础。
关键词：枯草芽孢杆菌；pgsA基因；克隆；序列分析
枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是农业部批准的可应用在新型微生态饲料添加剂中的一种益生菌，是一种短杆状、无荚膜、能运动的革兰氏阳性好氧菌，具有很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性及耐酸、耐盐、耐高温和耐挤压的特性，作为饲用微生态制剂及污水处理剂已得到广泛应用[1-4]。
枯草芽孢杆菌的染色体上有聚-γ-谷氨酸合成酶复合体A(poly-γ-glutamic acid synthetaseA，pgsA)基因，由1143个核苷酸组成，编码381个氨基酸。pgsA基因与pgsB、pgsC共同组成聚-γ-谷氨酸合成酶系的基因簇，这3个基因对聚-γ-谷氨酸(poly-γ-glutamicacid，γ-PGA)的合成缺一不可，其中pgsA基因能使γ-PGA合成酶系稳定地锚定在细胞膜上，是γ-PGA的运输载体，并对γ-PGA的延长起重要作用[5-6]。pgsA蛋白在靠近其N端26～42氨基酸残基处有一个跨膜区[7]，该跨膜区的存在，为建立pgsA跨膜表达体系提供了条件。将pgsA基因与目的基因连接进行融合性表达，并运用乳酸杆菌作为递送外源抗原载体的优点，构建新型的口服基因工程疫苗并加以运用，将具有极其广阔前景。基于pgsA基因的特殊功能，研究对枯草芽孢杆菌pgsA基因进行克隆及序列分析，为跨膜表达体系的建立和新型口服基因工程疫苗的研制奠定一定的基础。
1 材料与方法
1.1 试剂和细菌
高保真Taq DNA聚合酶、各种限制性内切酶均购自北京赛百盛基因技术有限公司；pMD18-TVector购自宝生物工程(大连)有限公司；超薄琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和细菌DNAout(G＋)均购自绵阳高新区天泽基因工程有限公司；E.coliDH5α和Bacillus subtilis由动物传染病实验室保存。
1.2 引物的设计与合成
根据GenBank中已发表Bacillus subtilis pgsA的基因序列，应用Primer5.0软件设计合成了一对能扩增1225 bp基因片段的引物，序列如下：
P1：5′-AAGGTGTGTCAAACGATG-3′
P2：5′-ATGAACACGATGGCTACG-3′
由北京赛百盛基因技术有限公司合成。
1.3 枯草芽孢杆菌基因组DNA的提取
挑取枯草芽孢杆菌单菌落，接种到5 mL营养肉汤中，37 ℃振荡培养过夜，参考细菌DNAout(G＋)试剂盒说明书提取全基因组。
1.4 PCR体系与反应条件
以提取的枯草芽孢杆菌全基因组DNA为模板，用合成的引物进行PCR扩增，采用25 μL的PCR反应体系：5 ng DNA模板，2.5μL 10×PCR buffer,0.5 μL上游引物(25 μmol/L),0.5 μL下游引物(25 μmol/L),1.25 UTaq DNA聚合酶，19.25 μL ddH2O，优化的PCR反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min,52.2 ℃1 min,72 ℃ 1 min 30 s，30个循环；72 ℃ 10 min。5 μL PCR产物用10g/L琼脂糖凝胶进行电泳，观察结果。
1.5 目的片段的回收、纯化及序列测定
参照超薄琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明回收纯化目的片段，然后将其与pMD18-T载体连接，将连接产物转化感受态细胞DH5α，挑斑，扩大培养，抽提重组质粒进行酶切鉴定和PCR鉴定[8]，将鉴定为阳性克隆的菌液送宝生物工程(大连)有限公司测序。
1.6 pgsA基因序列分析
利用DNAStar软件对所测定的pgsA基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行编辑，并与GenBank中的序列进行同源性比较，然后用ProtScale软件对pgsA蛋白的空间进行模拟分析。
2 结果
2.1 pgsA基因的PCR扩增
以枯草芽孢杆菌DNA基因组为模板，应用合成的P1和P2引物进行PCR反应扩增pgsA基因，所获得的PCR产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳呈单一条带，大小约为1 225 bp，与预期结果相符(图1)。
M.DNA标准DL 2 000；1～3.Products of PCR
M.DNA Marker DL 2 000；1-3.PCR扩增产物
图1 PCR扩增结果
Fig.1 Results of PCR
2.2 重组质粒pT pgsA的PCR鉴定
将重组质粒pT pgsA转化E.coli DH5α感受态细胞，获得大量重组转化子。从中随机挑选几个
重组子单菌落，以PCR方法进行鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果显示，以引物P1和P2扩增得到了大小约为1 225bp的特异性片段，表明所检测的克隆中含有目的片段。
2.3 重组质粒pT pgsA的双酶切鉴定
重组质粒pT pgsA经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后，得到大约1 261 bp的插入片段和大约2 656bp的载体片段，证明所挑取的克隆为正确的重组转化子(图2)。
M.DNA标准DL 2 000；1～2.重组质粒pTpgsA的PCR鉴定；
3～4.重组质粒pTpgsA的双酶切鉴定
M.DNA Marker DL 2 000；1-2.PCR identification of pTpgsA；
3-4.pTpgsA digested with BamHⅠ/HindⅢ(1 261 bp＋2 656 bp)
图2 重组质粒pTpgsA鉴定结果
Fig.2 Identification of recombinant plasmid pTpgsA
2.4 pgsA基因的序列测定
将阳性克隆的菌液进行测序，测定序列与GenBank中的序列进行同源性比较，结果表明，pgsA基因开放阅读框大小为1 143bp，编码381个氨基酸。用DNAStar软件将其与GenBank中的序列进行同源性比较，结果表明，试验株pgsA基因与GenBank中AB016245(pgsA)、AB039950(capA)、ABO46355(ywtB)、Z92594(ywtB)、DQ086153(pgaA)基因核苷酸同源性分别为90.1%、90.2%、90.0%、90.0%、89.9%(表1)。再根据它们的核苷酸序列绘制系统进化树(图3)，结果表明，试验株与浙江株在进化上亲缘关系最近。用ProtScale软件对pgsA蛋白的分析结果表明，pgsA蛋白靠近N端存在一个跨膜区(图4)。
表1 不同枯草芽孢杆菌pgsA相似基因的核苷酸同源性比较
Table 1 Nucleotide homologies between similar pgsA genes ofdifferent B.subtilis
图3 枯草芽孢杆菌pgsA相似基因核苷酸序列系统进化树
Fig.3 Phylogenetic tree of deduced amino acid of B.subtilis pgsAgene
图4 pgsA蛋白跨膜区分析
Fig.4 The analysis of transmembrane domain of the pgsA protein
3 讨论
本研究用DNA基因组为模板，通过PCR方法成功克隆得到了pgsA基因，进一步说明了pgsA基因位于枯草芽孢杆菌的染色体上，与OnoderaK等[9]报道的编码γ-PGA聚合酶的基因位于染色体上的结果是一致。试验株pgsA基因与GenBank中AB016245(pgsA)，AB039950(capA)，ABO46355(ywtB)，Z92594(ywtB)，DQ086153(pgaA)基因序列进行分析比较，是因为它们都是编码枯草芽孢杆菌γ-PGA聚合酶的部分基因，且它们开放阅读框大小相同，序列同源性很高，达到90%以上，有的甚至于达到99.8%，并且其编码蛋白的功能相似。基因命名不同的原因可能因为不同来源的枯草芽孢杆菌产生γ-PGA的过程差异或编码蛋白功能存在差别所造成。因为发现有的菌株产生γ-PGA，有的菌株不产生γ-PGA，还有的基因却是用来合成细菌荚膜的等等。由于枯草芽孢杆菌培养条件和遗传特性的不同，只有少数的枯草芽孢杆菌产生γ-PGA，再者对枯草芽孢杆菌γ-PGA合成酶酶系的了解有限，研究很少。虽然提出了一些关于γ-PGA合成机制的假说，但运用该方法发现对γ-PGA合成的重复性极差，因而关于基因命名的统一仍有待于进一步的研究与交流。
试验株pgsA基因核苷酸序列同源性低的原因可能有以下两种：①本研究所用的枯草芽孢杆菌为实验室分离株，由于时间和地点的差异可能导致核苷酸序列的差异；②对pgsA基因的研究很少，GenBank中登录的pgsA基因只有6个，分别为日本、中国、法国3个国家提交。系统进化树中试验株与ZJU-7株在进化上距离最近，同属于中国株，进化树上距离的远近从一定程度上体现了地域的差别，这与因地理位置的差异而引起核苷酸序列的差别的说法是吻合的。pgsA基因在靠近其蛋白的N端存在一个跨膜区，这与AshiuchiM等[10]报道的pgsA蛋白靠近其N端26个～42个氨基酸处存在一个跨膜区是相符的，与pgsA基因能使γ-PGA合成酶系稳定地锚定在细胞膜上的功能也是一致的。
pgsA蛋白跨膜区的存在，为跨膜表达体系的建立奠定了良好的基础。Lee JS等[11]用pgsA基因建立了一种新的表达体系，使SARSS糖蛋白表达在干酪乳杆菌的外表面，并成功地诱导了黏膜免疫的产生，避免了弱毒疫苗毒力返强和灭活疫苗不能有效诱导黏膜免疫的缺点。本研究成功地克隆得到了pgsA基因，从而为跨膜表达体系的建立和新型口服基因工程疫苗的研制奠定了一定的基础。