摘 要：根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2 )ORF2基因序列，设计了1对引物，应用PCR从广西PCV-2的DNA扩增出ORF2基因，将ORF2基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(＋)载体上，获得重组质粒，经PCR酶切以及序列分析鉴定，表明插入的片段为ORF2目的基因，插入的位置、大小和阅码框均正确，成功构建了真核表达载体重组质粒pcDNA-PCV-ORF2。对阳性真核表达质粒pcDNA-PCV-ORF2大量抽提后，以每只小鼠0.2mg免疫5周龄左右的雌性小鼠，然后用ELISA检测免疫小鼠血清中抗体的产生情况，同时进行pcDNA-PCV-ORF2的体内分布和安全性检测。结果表明，pcDNA-PCV-ORF2在小鼠体内广泛存在，产生了抗猪圆环病毒的特异性抗体，从第7天开始产生抗体，第28天抗体水平达到最高，抗体可维持7周以上，并具有良好的安全性。本研究通过对小鼠的免疫试验，产生了猪圆环病毒的特异性抗体，表明成功构建了能够在活体细胞中高效表达的真核表达载体，为进一步研究猪圆环病毒DNA疫苗奠定了基础。
关键词：猪圆环病毒2型；ORF2基因；pcDNA3.1(＋)；免疫保护
猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是迄今发现的一种最小的动物病毒[1]，其基因组为单股环状DNA。最早发现的PCV不引起猪发病，称其为PCV-1，而以后发现的能引起猪发病的PCV，称其为PCV-2 。PCV-2 是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaningmultisystemic wastingsyndrome，PMWS)的主要病原体[2]。PMWS不仅给养猪业造成严重的经济损失，同时其作为一种新的人畜共患传染病[3]，也给人类健康构成了威胁。
随着对PCV-2致病性研究的深入，近年来发现该病毒还与猪的呼吸与繁殖障碍综合征、皮炎与肾病综合征(PNDS)、幼龄猪的先天性震颤等疾病有关[4-8]。由于到目前为止，还没有有效预防PCV-2感染的疫苗，致使PMWS等疾病有不断蔓延之势，已成为影响养猪业发展的重要传染病之一[9-10]。
PCV-2基因组含有11个ORF，分别命名为ORF1～ORF11，其中以ORF1和ORF2的研究较深入。研究表明，ORF1相对保守，主要编码病毒的复制蛋白，而ORF2相对变异较大，是主要的免疫原性基因[11]，能诱导中和抗体的产生。本研究构建了广西PCV-2ORF2基因的真核表达质粒，并对其免疫效果进行研究，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 质粒、细胞、菌株和试剂
pcDNA3.1(＋)表达载体购自Promega公司；广西猪圆环病毒2型，受体菌DH5α由本实验室保存；LB培养基和凝胶回收试剂盒购自GIBCOL公司；PCR试剂盒购自TaKaRa公司；PCV-2抗体检测试剂盒购自华中农业大学动物病毒室；质粒提取试剂盒，HRP标记的羊抗小鼠IgG购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司；普鲁卡因购自天津药业集团新郑股份有限公司。
1.2 重组表达载体pcDNA-ORF2的构建
1.2.1 引物设计 参照GenBank中的PCV-2参考序列，设计一对ORF2的特异性引物ORF2-5和ORF2-6，扩增大小为702bp。引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。引物序列如下：
ORF2-5：5′-TCGGGATCCGATATGACGTATCCAAG-3′
ORF2-6：5′-CGGCTGGAGTTAAGGGTTAAGTGGGG-3′
1.2.2 DNA的提取 称取0.05 g感染广西猪圆环病毒2型的组织，加入500 μL组织裂解缓冲液(200 mmol/LNaCl,10 mmol/Tris-HCl，100 mmo1/L EDTA,0.5% SDS，pH8.0)进行匀浆，倒入一离心管中，3 000 r/min离心10 min；取上清加入50 μL蛋白酶K(20 mg蛋自酶K用1mLTE缓冲液溶解),50 ℃裂解3 h；加入等体积的酚∶氯仿，12 000 r/min离心10min，取上清加入两倍体积的无水乙醇置－20 ℃沉淀40 min；12 000 r/min离心10 min，然后加入1 mL 700mL/L乙醇洗涤1次，12 000 r/min离心5 min；弃上清，沉淀于室温干燥，加入适量的TE溶解沉淀，置－20 ℃保存备用。
1.2.3 ORF2基因的PCR扩增 PCR反应体系100 μL(3 μL 8 mmol/L MgCl2,2.5 μL 10mmol/L dNTP,10 μL 10×PCR缓冲液，上游引物和下游引物各2 μL，0.5μL(2.5U)TaqDNA聚合酶，用无菌水加至总体积为100 μL)，首先94 ℃ 5 min；然后进入94 ℃ 1 min,55℃ 1 min,72 ℃ 1.5 min的循环，循环35次；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。
1.2.4 ORF2基因的克隆 用DNA片段回收试剂盒，切胶回收目的片段，经EcoRⅠ和NotⅠ酶双酶切，取纯化的ORF2基因产物按2∶1(浓度比)的比例与经同样双酶切克隆载体pcDNA3.1(＋)混匀，反应体系为10×buffer1 μL，PCR回收产物(200 mg/L)4 μL，pcDNA3.0(＋)载体(100 mg/L)2 μL，T4连接酶1 μL，ddH2O 1 μL。16 ℃连接过夜(16 h)。吸取10 μL连接产物，分别加入到200 μLDH5α(CaCl2法制备)感受态细胞中，随后冰浴30 min，42 ℃ 1.5 min，冰浴1 min～2 min，加入800μL无Amp的LB培养液于37 ℃摇床振荡培养45 min。然后吸200 μL均匀涂布于含有Amp(终浓度为100mg/L)的LB琼脂平板上，待液体吸干后37 ℃预热20 min，倒置平板，于37℃培养过夜。挑选呈白色菌落的重组质粒，经PCR初步鉴定后，用BamHⅠ和XhoⅠ酶进行双酶切鉴定，将鉴定的阳性重组质粒命名为pcDNA-PCV-ORF2，提取阳性菌落的质粒DNA测序。
1.3 阳性真核表达质粒的大量生产
将阳性重组质粒划线于含有Amp的LB琼脂平板上，挑取单个菌落在含Amp(终浓度为100 mg/L)的LB培养基中37℃振荡培养过夜。使用质粒提取试剂盒提取重组质粒DNA。经紫外分光光度计测定OD260值，计算重组质粒DNA的浓度。
1.4 免疫接种
5周龄左右雌性小鼠，购自广西中医学院实验动物中心，随机分成3组，试验组25只，空质粒对照组8只，空白对照组8只。免疫前3d用普鲁卡因进行预处理，然后分别于腿部肌肉注射空载体pcDNA3.1(＋)(每只0.2mg)、pcDNA-PCV-ORF2(每只0.2 mg)和PBS，每隔14 d免疫1次，共免疫2次。
1.5 样品采集
第1次免疫后分不同时间(3、7、14、21、28、35、45、52d)取出小鼠，其中每次试验组取2只，对照组取1只，用眼科剪剪去小鼠的一只眼球，用离心管收集血液，离心取血清。随后处死小鼠取肝、脾、肾、肺、心脏、肌肉及脑组织，置－20℃保存备用。
1.6 小鼠抗体水平的检测
取采集的血清，用辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体代替试剂盒中的酶标二抗，优化条件后，按ELISA诊断试剂盒中的步骤检测小鼠血液中特异性抗体的变化。
1.7 pcDNA-PCV-ORF2在小鼠体内的分布的检测
将1.5采集的病料进行抽提和PCR检测(方法同1.2.2和1.2.3)。
1.8 pcDNA-PCV-ORF2的安全性检测
组织DNA的分离纯化按UltraPure™基因组DNA提纯试剂盒使用说明进行操作。取各纯化基因组样品1μL进行PCR扩增(方法同1.4)。
2 结果
2.1 真核表达质粒的PCR和双酶切鉴定
对重组真核表达质粒进行PCR和双酶切鉴定，发现PCR扩增及酶切消化后所得目的片段均与预期大小一致(图1)，证明已成功将ORF2基因连接到了真核表达载体pcDNA3.1(＋)上。
1.λDNA/EcoR Ⅰ＋Hind Ⅲ Markers；2.pcDNA-PCV-ORF2双酶切
1.λDNA/EcoR Ⅰ＋Hind Ⅲ Markers；2. pcDNA-PCV-ORF2 double digested
图1 pcDNA-PCV-ORF2的双酶切鉴定
Fig.1 Identification of pcDNA-PCV-ORF2 by double digestion
2.2 免疫小鼠血清中的特异性抗体水平
采用间接ELISA方法测定免疫小鼠血清抗PCV-2抗体水平的动态变化，结果见图2。本研究所构建的pcDNA-PCV-ORF2核酸疫苗质粒能在一定程度上诱导特异性抗体产生，在一免后第7天就开始产生抗体，在一免后第28天抗体水平达最高值，OD630nm值达0.67。
图2 pcDNA-PCV-ORF2免疫接种小鼠后抗体的变化曲线
Fig.2 Change of antibody response in mice immunized withpcDNA-PCV-ORF2
2.3 pcDNA-PCV-ORF2的分布检测结果
从接种后第3、7、14、21、28、35、45天的小鼠血液、脑、心脏、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏及肌肉组织中均能扩增出目的基因片段。但在第52天的脑和肺组织PCR结果为阴性，其他组织仍出现阳性结果。
2.4 安全性检测结果
为了确定pcDNA-PCV-ORF2对宿主的安全性，对小鼠不同时间段采集的不同组织样品DNA进行了PCR，纯化的基因组未扩增出任何条带，说明pcDNA-PCV-ORF2在宿主体内具有良好的安全性。
3 讨论
3.1 目的基因选择
ORF2基因是PCV-2的重要抗原基因，编码病毒的核衣壳蛋白，该蛋白具有良好的抗原性，具有构建核酸疫苗的价值。因此，本试验用ORF2基因构建真核表达质粒，进行免疫试验。
3.2 真核表达质粒的构建
现有研究表明，巨细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)早期启动子表达外源基因时几乎没有细胞特异性，适于大多数哺乳动物细胞，而且它有一段至今为止发现的最强的增强子序列[12]。真核表达载体pcDNA3.1(＋)带有CMV早期启动子，能够在广泛的动物细胞中高效表达，故本试验选用了pcDNA3.1(＋)载体作为PCV-ORF2的表达载体。
本试验通过猪圆环病毒ELISA诊断试剂盒粗略地检测了pcDNA-PCV-ORF2免疫小鼠后的抗体变化，在免疫接种后第1周就开始产生特异性抗体，抗体水平逐渐上升，表明真核表达质粒pcDNA-PCV-ORF2免疫小鼠后，机体产生针对PCV-2的特异性抗体，说明所构建的pcDNA-PCV-ORF2已成功转染小鼠体内细胞并在细胞中表达，表达产物作为抗原刺激机体产生了免疫应答反应。二免后，试验组小鼠的抗体水平上升幅度很大，在第28天达到最高，其后水平缓慢下降，表明pcDNA-PCV-ORF2免疫后能够刺激小鼠机体产生特异性中和抗体，且pcDNA-PCV-ORF2能够诱导机体免疫系统中的B淋巴细胞产生免疫记忆反应。
本试验仅仅用pcDNA-PCV-ORF2裸质粒免疫小鼠，检测其免疫原性。在后续的研究中还要在猪群上进行免疫，检测猪体内的特异性抗体、细胞免疫水平。如何增强pcDNA-PCV-ORF2的免疫效果是以后我们研究的重点，将pcDNA-PCV-ORF2与各种免疫佐剂联合免疫猪，或将ORF2基因与猪白细胞介素的编码基因进行连接重组，克隆到真核表达载体中构建成嵌合基因真核表达质粒，以期更有效地提高小鼠或猪产生中和抗体和细胞免疫。
3.3 pcDNA-PCV-ORF2的分布
质粒DNA在动物体内的分布和存留时间是评价DNA疫苗的重要内容。一个理想的核酸疫苗应较长时间存在细胞内，能持续产生适量的蛋白抗原刺激免疫系统，产生淋巴毒性T淋巴细胞、抗体及保护性免疫应答。
试验采用PCR法检测了pcDNA-PCV-2-ORF2在小鼠内动态分布情况，结果表明，小鼠血液、心脏、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏、肌肉及脑组织在接种后3 d～45d都能检测到与预期片段大小相一致的核酸片段，表明质粒DNA通过肌肉注射方式进入机体后能迅速到达体内各组织器官。本试验对小鼠体内的分布说明了pcDNA-PCV-ORF2在机体分布具有广泛性，与ChunS等[13]的报道结果基本吻合。
3.4 pcDNA-PCV-ORF2的安全性
质粒DNA免疫动物后的安全性一直是人们关注的问题。不管是在临床表现观察还是在基因组的研究，质粒DNA在机体组织器官内的安全性报道非常多。本试验通过PCR检测质粒DNA与宿主染色体基因是否整合来证明重组质粒pcDNA-PCV-ORF2在小鼠体内的安全性。小鼠的各组织基因组DNA经处理去除游离的质粒后，PCR扩增结果均为阴性。PCR反应的敏感度可以达到几十个甚至几个拷贝，但本试验PCR从纯化的基因组DNA中未扩增出任何DNA条带，在这种情况下随机插入整合的最大可能性为5.2× 10－9[14]，表明pcDNA-PCV-ORF2在小鼠体内具有较好的安全性。