摘 要：利用体外环化的猪圆环病毒2型(PCV-2)全基因的感染性，建立一种分离PCV-2的方法。根据GenBank中PCV-2的基因序列，设计合成1对扩增PCV-2全基因组的特异性引物。通过PCR方法从广东发病猪病料扩增到PCV-2全基因组片段，将该片段克隆入pMD18-T载体，筛选获得阳性重组质粒pMDT-YF并测序。将所测序列与GenBank中发表的PCV毒株序列进行同源性比较。将质粒pMDT-YF大量扩增，经SacⅡ酶切质粒得到PCV-2全基因组，通过T4连接酶体外环化后，脂质体介导转染PK-15细胞，盲传8代。用间接免疫荧光抗体试验(IFA)可检测到特异性荧光。将转染细胞稀释后接96孔细胞培养板，培养3d。用荧光定量法检测各孔的PCV-2拷贝数，选择拷贝数最大的细胞扩大培养，经IFA法测定病毒滴度显著增加。结果表明，利用具有感染性的体外环化的全基因组的克隆转染PK-15细胞，并通过选择压力可获得较高滴度的具有感染性的PCV-2。
关键词：猪圆环病毒2型；分离；基因组
猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)为圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属成员，成熟的病毒粒子为二十面体对称，无囊膜，直径17nm，是已发现的最小的一种脊椎动物病毒。核酸为单股环状双向DNA。沉降系数为52 S，病毒基因组在氯化铯中原浮力密度为1.37mg/mL。PCV以滚环方式复制[1]。根据PCV的致病性、抗原性和核苷酸序列分为PCV-1和PCV-2两个型。PCV1是1974年TischerI等首次分离到的。当时在PK-15细胞系ATCC－CCL31的传代过程中发现了类似细小病毒和乳多空病毒的颗粒，由于这种颗粒物质不引起细胞病变，被认为是一种细胞污染物[2]。PCV-1广泛存在于猪源肾细胞中，无致病性。PCV-2基因型分两种，一种为1767 bp，另一种为1 768 bp。PCV-2首先由Allan等从患断奶后仔猪多系统衰竭综合征(Postweaningmultisystemic wastingsyndrome，PMWS)的猪群中分离到，是PMWS的主要病原，但不是惟一的病原[3]。PCV-2感染主要侵害猪免疫系统，能降低猪体免疫力，常引起继发或并发感染，加重病情。该病在世界许多国家和地区的广泛流行，已经造成了巨大的经济损失，严重影响着世界养猪业的发展[4-6]。
近几年来发现PCV-2和猪皮炎与肾炎综合症(Porcine dermatitis and nephropathysyndrome，PDNS)、增生性坏死性肺炎(Proliferativenecrotisingpneumonia，PNP)、猪呼吸道综合征(Porcine respiratory diseasecomplex，PRDC)、繁殖障碍、先天性颤抖、肠炎等疾病有重要关联[7]。临床上PCV-2常与呼吸与繁殖障碍综合征病毒(Porcinereproductive and respiratory syndromevirus，PRRSV)[8-10]、细小病毒(Porcineparvovirus，PPV)[8,10]、伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)[11-12]、猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)[10]等，以及其他一些病原微生物混合感染，而PCV-2、CSFV、PPV等病毒在PK-15细胞上又不产生细胞病变[1]，给PCV-2病毒的分离工作带来一定的困难。本研究用PCR方法克隆获得PCV-2全基因组，然后将体外环化的全基因组的克隆转染PK-15细胞，用荧光定量PCR方法检测出拷贝数高的病毒继续筛选可获得较高滴度的具有感染性的纯化的PCV-2，为开展病毒的免疫和致病机理研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
猪病料(淋巴结)采自广东发病猪群；无PCV-1污染的PK-15细胞、大肠埃希菌(Escherichia coli)DH5α为广东省农业科学院兽医研究所猪病研究室保存；pMD18-T载体、PCR试剂盒、基因组DNA提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒、DNAMarker荧光定量试剂及各种限制性内切酶均为TaKaRa公司产品；PCV-2-ORF2蛋白单克隆抗体4G8由广东省农业科学院兽医研究所猪病研究室制备；FITC标记的山羊抗鼠IgG购自北京鼎国生物技术有限公司进口分装；其他试剂均为进口或国产分析纯试剂。
1.2 引物设计
根据GenBank中发表的PCV-2的基因组序列，设计合成1对扩增PCV-2全基因组的特异性引物，该引物5′端包含有一重叠的SacⅡ位点。引物序列如下：
P1：5′-GACCGCGGGCTGGCTGAACTTTTGAAAGT-3′
P2：5′-GACCCGCGGAAATTTCTGACAAACGTTACA-3′。
1.3 PCR模板制备和全基因组的扩增
将猪病料研磨制成悬浮液，冻融3次，12 000 r/min离心5min，取上清，然后参照基因组DNA提取试剂盒(TaKaRa公司)产品说明书制备PCR模板。PCR引物浓度为10pmol/L，整个反应体系25 μL，反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 1 min,56 ℃ 1 min,72 ℃ 3min，循环扩增35次；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。
1.4 PCR产物的克隆与序列分析
用DNA胶回收试剂盒回收PCR产物，将目的片段连接入pMD18-T载体中，按常规方法转化E.coliDH5α感受态细胞，接种于含有氨苄青霉素(100 μg/mL)的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒并进行酶切鉴定，筛选获得含有相应片段的阳性重组质粒(命名为pMDT-YF)并由宝生物工程(大连)有限公司测序。用DNAStar软件分析测序结果，并与GenBank中已发表的PCV毒株的基因组序列做同源性比较。
1.5 脂质体介导PCV-2转染PK-15细胞
大量扩增阳性重组质粒pMDT-YF，然后用SacⅡ酶切该质粒，再用胶回收线性化后的PCV-2全基因组DNA，最后用T4DNA连接酶16℃连接过夜。纯化后定量，参照脂质体(Ipofectamine™2000，Invitrogen)产品说明书转染PK-15细胞。转染后的细胞继续培养4d，然后盲传8代。
1.6 间接免疫荧光抗体试验(IFA)
将盲传8代的转染细胞消化培养于24孔培养板，同时以无PCV-2感染的细胞作为阴性对照。待细胞长成单层后，弃上清，PBS洗3次，室温条件下用丙酮固定10min。然后于37 ℃用100 mL/L小牛血清封闭30min；弃封闭液，再用PBS洗3次，然后加入PCV-2-ORF2蛋白单克隆抗体4G8于37 ℃孵育60min，而后PBS洗3次，加入FITC标记的兔抗鼠荧光二抗于37 ℃继续孵育30min；最后用PBS洗3次，置荧光显微镜下观察。观察有绿色荧光者判为阳性，无荧光者判为阴性。
1.7 转染细胞的荧光定量筛选
将转染细胞(8P)稀释后接96孔细胞培养板，每孔约5×102个细胞，培养3d。选细胞生长良好的培养孔抽取其病毒培养液，然后提取总DNA，用荧光定量PCR方法检测每孔的PCV-2拷贝数，取病毒拷贝数最大孔的细胞(9P)扩大培养再传96孔板，再用荧光定量PCR方法选取拷贝数最大的细胞(10P)扩大培养并收获病毒。
荧光定量PCR的引物和探针为：Primer1：5′-CGCTGGAGAAGGAAA AATGG-3′；Primer2：5′-CTTGACAGTATATCCGAAGGT-3′；Probe：FAM-5′-TTCAACACCCGCCTCTCCCG-3′-TAMRA。扩增反应总体积为25μL：Realtime PCR Premix 12.5 μL，Rox Referebce Dye 0.5 μL，上下游引物各0.5μL，探针0.5 μL，模板1 μL，余下用灭菌DEPC水补足，均匀混合。反应程序为：94 ℃ 30 s；然后94 ℃ 10 s,60℃ 30 s，进行40个循环，最后于4 ℃结束反应。
1.8 分离病毒的含量测定
取第1代、第8代、第10代的病毒培养物用MEM培养液10倍系列稀释，取100 μL接96孔细胞培养板，再加入100 μL5×105个/mL的PK-15细胞悬液，每个样品设4个重复孔，培养3d。用IFA法检测长成单层的细胞，然后按Reed-Muench法计算病毒TCID50。
2 结果
2.1 PCR扩增及PCR产物的克隆
PCR扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳，紫外观察可见PCR扩增产物出现了大小为1.8kb左右的特异条带，与预期结果相符(图1)。PCR产物纯化后与pMD18-T载体连接，转化E.coliDH5α，提取质粒，经SacⅡ酶切鉴定，命名为pMDT-YF(图2)。
1.PCV-2 PCR产物；M.DNA标准DL 2 000
1.PCR products of PCV-2；M.DNA Marker DL 2 000
图1 PCV-2的PCR扩增结果
Fig.1 Amplification fragments for PCV-2 isolates by PCR
1.重组质粒SacⅡ酶切产物；M.DNA标准DL 2 000
1.The products of recombination plasmid digested；M.DNA Marker DL 2000
图2 重组质粒的酶切鉴定结果
Fig.2 Identification the recombination plasmid by digestion withdifferent restriction enzymes
2.2 序列分析
测序结果表明，GDYFJ株(EU283329)PCV-2毒株基因组全长为1 767bp。将所测序列与GenBank收录的不同地区和国家的11株PCV-2毒株及3株PCV-1毒株，应用DNAStar分析软件进行核苷酸同源性比较(表1)发现，GDYFJ株和其他地区和国家分离的PCV-2毒株的核苷酸序列同源性较高，均在95.5%以上，最高可达99.6%。与加拿大毒株(DQ220739)，丹麦毒株(EU136720)的核甘酸序列同源性分别为99.4%和99.5%，与广东毒株(AY916791、AY613854)和广西毒株(EF675742)的同源性为99.3%～99.6%。与美国毒株(EF452352)、澳大利亚毒株(AY754020)、台湾毒株(AY180397)，海南毒株(AY556476)、北京毒株(EF524539)的核甘酸序列同源性为95.6%～96.2%。而与3株PCV-1毒株的核苷酸序列同源性仅为77.6%～77.8%(表1)。
从图3系统进化树可以看出，PCV分成PCV-1及PCV-2两个分支，3株PCV-1毒株形成PCV-1分支，其他13株PCV-2毒株形成PCV-2分支。而PCV-2分支又分为两支，国内分离株与国外分离到毒株分别分布在两个分支。GDYFJ株(EU283329)与广东、广西分离到的毒株亲缘关系较近，而与北京毒株和海南毒株亲缘关系相距较远。我国分离到的毒株之间存在一定的变异。美国毒株、德国毒株和台湾毒株相对独立自成一分支。
2.3 间接免疫荧光检测
利用本实验室制备的PCV-2-ORF2蛋白单克隆抗体4G8作为一抗，对盲传8代的转染细胞进行IFA检测。在荧光显微镜下阳性细胞可见清晰的细胞核浓染及细胞将荧光染色，但呈现特异性黄绿色荧光的细胞比较少。由此表明转染体外环化PCV-2全基因组的PK-15的细胞中已有PCV-2的病毒[10]，但转染的效率不高(图4)。
表1 GDYFJ株与其他PCV-2毒株的同源性比较
Table 1 Homological comparision of the nucleotides of PCV-2 OFGDYFJ with other strains
图3 PCV-2 GDYFJ株的全基因组系统进化树
Fig.3 Phylogenetic tree of PCV-2 of GDYFJ based on complete genomesequence
A.转染环化PCV-2的PK-15细胞；B.无PCV-2感染的PK-15细胞
A.PK-15 cells transfected with PCV-2 circular genomes ；B.Non-transfected PK-15 cells
图4 转染PK-15细胞的IFA结果
Fig.4 IFA results of transfected PK-15 cells
2.4 荧光定量筛选检测
盲传8代后的细胞(第8代)荧光定量测定CT值为28.19，COPY数为105.43个/mL。筛选第9代的细胞(第9代)中最大COPY数的CT值为26.59，COPY数为105.92个/mL。筛选第10代的细胞(第10代)中最大拷贝数的CT值为22.60，拷贝数为107.14个/mL。结果表明，病毒含量随着传代逐步增加，即通过压力筛选可以提高PCV-2的浓度，从而获得较高浓度的纯化的PCV-2病毒，结果见图5。
A.第10代的细胞；B.第9代的细胞；C.盲传8代的细胞；D.空白对照
A.Cells in generation 10；B.Cells in generation 9；C.Cells ingeneration 8；D.Blank control
图5 PCV-2 FQ-PCR检测结果
Fig.5 Results of FQ-PCR for PCV-2 detection
2.5 分离病毒的序列比较和TCID50测定
第1代的毒价为101.56 TCID50/0.1 mL，第8代的毒价为102.80TCID50/0.1mL，第10代的毒价为103.55TCID50/0.1mL。病毒在细胞传代的过程中，逐渐适应细胞使得毒价随代次升高。通过荧光定量压力筛选毒价明显增高，比盲传的毒价增加效率要高。
3 讨论
本次分离到的毒株来自2007年5月送检的疑似猪高致病性蓝耳病(PRRSV)的猪体淋巴结。PCV-2经常与PRRSV或PPV并发感染或继发细菌感染，使患病猪病情加重，造成巨大的经济损失。而且细胞培养不产生细胞病变，给PCV-2病毒的分离工作带来极大的困难。本试验选择PCV-2基因组上惟一的SacⅡ位点设计1对引物，一次性扩增出分离到的GDYFJ株全基因组，构建重组质粒pMDT-YF，用SacⅡ切出PCV-2全基因组，体外环化后转染PK-15细胞，利用PCV-2全基因组的感染性纯复制出完整的病毒。也用重组质粒pMDT-YF转染PK-15细胞，但IFA没有检测到特异性荧光。
GDYFJ株与广西毒株亲缘关系较近，与德国毒株亲缘关系较远，而GDYFJ株与德国毒株是一个亚型，却与广西毒株亚型不同。这说明PCV-2的变异表现为碱基的插入、缺失和突变。荧光定量筛选对于筛选对细胞适应性强的病毒，从而提高病毒含量有一定的作用，但因为试验有一定的随机性，此方法还有待研究和改进。在试验中，曾尝试稀释到单个细胞，从中筛选阳性，但因单个的PK-15细胞很难培养而告失败。
本试验证实了从广东省分离的GDYFJ株基因组具有感染性，IFA结果显示得到了一株高纯度的PCV-2，这为进一步开展PCV-2感染性的研究，以及进行病毒的免疫和致病机理研究以及病毒的分子流行病学研究奠定了基础。