摘 要：通过注射链脲佐菌素(STZ)制作大鼠1型糖尿病模型，观察大鼠品系、给药剂量、给药次数对大鼠成模率、死亡率的影响，同时研究利用口服葡萄糖耐量试验(OGTT)判断大鼠糖尿病成模率的意义。随机取16只SD大鼠设置正常对照组。试验一：Wistar大鼠随机分为中剂量组(55mg/kg，n＝12)和高剂量组(65 mg/kg，n＝12)；试验二：SD大鼠一次性腹腔注射STZ(55mg/kg，n＝12)，与1中的Wistar大鼠作对比；试验三：SD大鼠随机分为一次给药组(n＝16)和两次给药组(n＝16)，注射剂量均为55 mg/kg，观察期间进行OGTT。结果表明，Wistar大鼠成模率和死亡率均高于SD大鼠；采用SD大鼠、中剂量给药和两次给药的方式可提高成模率，并降低死亡率；在有明确胰岛病理改变的模型组大鼠，其OGTT异常阳性率显著高于空腹血糖异常阳性率。用STZ诱导糖尿病模型是一种稳定可靠的方法。
关键词：链脲佐菌素；口服葡萄糖耐量试验；糖尿病；成模率；大鼠
糖尿病是医学界三大疑难病之一，其发病率在全球范围内呈逐渐增高趋势。目前，糖尿病及其并发症的病因、发病机理尚未完全阐明，其预防和治疗措施仍不完善，因此，建立较理想的动物模型来研究该病的发病机制、预防和治疗具有重要意义。
自1960年开始利用链脲佐菌素(streptozocin，STZ)诱发动物糖尿病模型以来[1]，STZ已成为目前广泛采用的糖尿病动物模型化学诱导剂。有研究指出大鼠尾静脉注射STZ成模率可达90%[2]，因腹腔注射较尾静脉注射容易、准确快速，现多采用腹腔注射法。判断造模成功的指标，研究中多采用测外周血糖、尿糖、血清胰岛素水平、C肽值等。国外有学者采用口服葡萄糖耐量试验(oralglucose tolerancetest，OGTT)作为判断与比较糖尿病情况的指标之一[3-5]，有学者在用STZ诱发大鼠糖尿病模型的研究中，但也只用空腹血糖值作为判断大鼠成模的指标[6-9]，较少使用OGTT。笔者在研究过程中发现，单用空腹血糖值无法反映出大鼠造模的真实情况，因此，本试验在观察大鼠品系、给药剂量、给药次数对大鼠成模影响的同时，研究与空腹血糖相比，OGTT对判断大鼠糖尿病成模的意义。
1 材料与方法
1.1 实验动物及饲养条件
清洁级Wistar雄性大鼠24只，清洁级SD雄性大鼠60只，体重170 g～200g，购于广州中医药大学实验动物中心，饲养于广州中医药大学实验动物中心SPF级实验室。标准化饲养房笼子喂养，饲以标准颗粒饲料，自由饮水。饲养环境温度为18℃～22 ℃，室内湿度保持在50%～70%，每天日照时间为8：00～20：00。试验前测定每只大鼠的血糖值范围在3.0mol/L～5.0 mmol/L之间，为正常血糖值，可以进行造模试验。
1.2 材料
STZ(Sigma公司，S0130)，将STZ粉末溶于pH 4.5的0.1 mol/L柠檬酸钠缓冲液，新鲜配制成10 g/LSTZ溶液，用0.2 μm微菌滤菌器过滤除菌；美国强生稳豪微量血糖测定仪(配套血糖试纸)。
1.3 方法
1.3.1 分组与造模方法 动物适应性饲养1周，饮食正常、体重不减轻，且尾尖采血测定血糖值正常的大鼠可用于试验。注射STZ前1d禁食不禁水24 h。 根据不同试验目的分为3个试验，同时进行。
随机取16只SD大鼠作为6个试验组的正常对照组，腹腔注射1 mL柠檬酸钠缓冲液。试验一采用24只Wistar鼠随机分为中剂量组(55mg/kg)和高剂量组(65 mg/kg)，每组12只，均一次性腹腔注射。试验二采用12只SD鼠一次性腹腔注射STZ 55mg/kg，与试验一注射剂量为55mg/kg的Wistar鼠作比较。试验三采用32只SD大鼠分为一次给药组和两次给药组。一次给药组一次性腹腔注射STZ 55mg/kg，两次给药组第1次腹腔注射STZ 55mg/kg，第8天行第2次腹腔注射同等剂量STZ，观察期间进行OGTT，并对比按空腹血糖值和OGTT结果分别计算出的大鼠成模率。以上试验均在注射STZ5 d后大鼠尾尖采血测空腹血糖值，观察8周，计算成模率和死亡率。
1.3.2 观察指标及检测方法 ①观察大鼠饮水量和一般状态，每周测量体重；②空腹血糖测定：大鼠禁食8h后尾尖采血，用微量血糖测定仪测血糖。③口服葡萄糖耐量试验(OGTT)：试验前一晚大鼠禁食，第2天测空腹血糖后，每只大鼠灌服500g/L葡萄糖，2.5 g/kg，测灌服葡萄糖后0.5、1、2、3 h的血糖值。
1.3.3 造模成功的判断标准 注射STZ 5 d后动物空腹血糖值>16.7mmol/L，或OGTT异常者，判定为1型糖尿病动物模型，并结合胰腺组织病理切片。
1.3.4 病理标本的采集和处理 试验结束后将大鼠处死，剖腹，观察胰、肝、肾等脏器是否有病变，用100mL/L福尔马林固定液固定、脱水，石蜡包埋，HE染色。
1.4 统计方法
采用SPSS 11.0软件进行统计分析。组间比较采用t检验，方差不齐时用F检验。
2 结果
2.1 不同STZ剂量对致大鼠糖尿病模型的影响
Wistar鼠中剂量组(55 mg/kg)的成模率和死亡率均为66.7%，高剂量组(65mg/kg)的成模率和死亡率均为100%(表1)。
表1 Wistar大鼠不同剂量组的造模情况
Table 1 Different dose groups of Wistar rat model
组别 Groups | 例数/只 Number | 成模数量/只 Modeling number | 成模率/% Modeling rate | 死亡率/% Mortality |
正常对照组 Normalcontrol group | 16 | 0 | 0 | 0 |
中剂量组 Middle dose group | 12 | 8 | 66.7 | 66.7 |
高剂量组 High dose group | 12 | 12 | 100 | 100 |
比较Wistar鼠和SD鼠在给药一次，剂量为55 mg/kg的条件下，以空腹血糖>16.7mmol/L为造模成功的标准。两个品系的大鼠其成模率分别为83.3%和33.3%，死亡率分别为83.3%和0(表2)。
表2 Wistar鼠和SD鼠的成模率与死亡率
Table 2 Modeling rate and mortality in Wistar and SD rats
大鼠品系 Rat lines | 例数/只 Number | 成模数量/只 Modeling number | 死亡数量/只 Dead number | 成模率/% Modeling rate | 死亡率/% Mortality |
Wistar | 12 | 10 | 10 | 83.3 | 83.3 |
SD | 12 | 4 | 0 | 33.3 | 0 |
SD大鼠一次给药的成模率为31.25%，死亡率为0，两次给药的成模率为50%，死亡率为0(表3)。
2.4 空腹血糖、OGTT异常阳性率在模型组的差异
在模型组中，随机同时检测空腹血糖和OGTT。结果发现，空腹血糖值与OGTT的异常阳性率分别为50%和75%，胰腺病理检测发现，OGTT异常的大鼠均有明显病理改变，即胰岛变小，密度减低，胰岛分布稀疏，胰岛细胞数量减少、肿胀，胞质着色浅，细胞核固缩。结果见表4和图1B，图1D。
表3 SD大鼠不同给药次数的造模情况
Table 3 Modeling situation of different administration times in SDrats
组别 Groups | 例数/只 Number | 成模数量/只 Modeling number | 成模率/% Modeling rate | 死亡率/% Mortality |
正常对照组 Normalcontrol group | 16 | 0 | 0 | 0 |
一次给药组 Administration once group | 16 | 5 | 31.25 | 0 |
两次给药组 Administrationtwice group | 16 | 8 | 50.00 | 0 |
Table 4 The differences of limosis blood glucose and abnormal OGTTrate in modeling rat groupmmol/L
编号 Number | 空腹血糖 Limosis blood glucose | 负荷后0.5 h 0.5 h after the glucose load | 负荷后1 h 0.5 h after glucoseload | 空腹血糖 Limosis blood glucose | OGTT |
1 | 6.1 | 15.6 | 15.1 | ||
2 | 25.1 | H1 | H1 | 异常 Abnorm, ity | 异常 Abnormity |
3 | 16.9 | H1 | H1 | 异常 Abnormity | 异常 Abnormity |
4 | 5.5 | 18.9 | 20.6 | 异常 Abnormity | |
5 | 19.2 | H1 | H1 | 异常 Abnormity | 异常 Abnormity |
6 | 18.1 | H1 | 28.9 | 异常 Abnormity | 异常 Abnormity |
7 | 2.1 | H1 | H1 | 异常 Abnormity | |
8 | 5.1 | 31.0 | 28.1 | 异常 Abnormity | |
9 | 5.8 | 21.2 | 28.0 | 异常 Abnormity | |
10 | 17.0 | 25.0 | 20.7 | 异常 Abnormity | 异常 Abnormity |
11 | 20.6 | H1 | H1 | 异常 Abnormity | 异常 Abnormity |
12 | 3.6 | 5.7 | 10.9 | ||
13 | 4.1 | 9.4 | 7.0 | ||
14 | 18.7 | H1 | H1 | 异常 Abnormity | 异常 Abnormity |
15 | 16.8 | 32.8 | 20.9 | 异常 Abnormity | 异常 Abnormity |
16 | 5.0 | 14.8 | 9.4 | ||
异常例数/只 Abnormal cases | 8 | 12 | |||
异常阳性率/% Abnornal rate | 50 | 75 |
Note：①Limosis blood glucose values>16.7 mmol/L asabnormity，blood glucose concentration after oral glucose sharplyincreased 2-3 hours before the service was unable to returnabnormal concentration；②H1 shows that blood glucose meter higherthan the value of numerical display range (>33.3 mmol/L).
2.5 一般状态
随着病程进展，模型组大鼠逐渐出现多饮、多尿、多食、毛失去光泽、脱毛、消瘦、活动减少和伤口易感染等表现。观察8周，模型组大鼠体重减轻20%，饮水量增加近180%。2个月后1只出现烂尾和糖尿病足，1只出现嘴角溃疡。
2.6 病理检查
将大鼠处死，取胰腺组织做病理检测。胰腺病理检测普通HE染色显示，正常对照组胰岛为圆形、卵圆形细胞团，界限清、无包膜，细胞团块大小不一，胰岛细胞数量较多，胞质丰富，核圆形，胰岛分布广(图1A，图1C)；糖尿病模型组胰腺常规HE染色中胰岛变小，密度减低，胰岛分布稀疏，胰岛细胞数量减少、肿胀，胞质着色浅，细胞核固缩(图1B，图1D)。
A.正常组胰腺胰岛(40×)；B.模型组胰腺胰岛(40×)；C.正常组胰岛和腺泡细胞(400×)；D.模型组胰岛和腺泡细胞(400×)
A.Normal islets of langerhans(40×)；B.Model islets oflangerhans(40×)；C.Normal islets of langerhans and pancreaticcells(400×)；D.Model islets of langerhans and pancreaticcells胞(400×)
图1 1型糖尿病大鼠模型的胰岛与胰腺细胞病理变化
Fig.1 The pathological changes of pancreatic islets and cells intype 1 diabetes rat model
3 讨论
STZ是一种广谱抗生素，具有抗菌、抗肿瘤的性能和致糖尿病的副作用[10]，对动物的胰岛β细胞具有高度选择性的毒性作用，现已广泛应用STZ制备糖尿病动物模型。有文献指出采取两步给药法，STZ剂量为10mg/kg，隔1 d给予50mg/kg，其成模率高，死亡率低，成模稳定[11]。本试验亦采用两次给药法，其成模率高于一次给药组，死亡率为0，到试验结束维持时间达3个月。
STZ成模率不及一些文献报道的可达80%～90%[12]，其原因可能是注射的剂量不同，实验大鼠间个体差异较大，也可能与地域差别及腹腔注射范围大，注射药物易误入皮下或腹腔脏器等有关。可通过加大STZ的注射剂量或尾静脉注射等方法来提高成模率，但随着剂量的增加，死亡率会有增加的趋势。HainanC等[13]报道造模未成功的大鼠，与一种抗氧化蛋白——金属硫蛋白Metallothionein(MT)作用有关，MT可在一些细胞中保护DNA免受化学损伤，推测是由于MT的过表达能够保护β细胞的DNA免受损伤，从而阻止了STZ导致糖尿病。
因STZ具有毒性和副作用，会导致大鼠死亡。试验一高剂量组Wistar大鼠注射STZ后7d内死亡率达100%,2个月仍存活的4只均属中剂量组。试验三中SD大鼠一次给药组和两次给药组注射STZ后均无死亡。其一与注射剂量有关，剂量大于大鼠可耐受程度，毒性或副作用导致大鼠死亡。其二可能与大鼠品系和体质有关。Wistar大鼠给药后成模率与死亡率均高于SD大鼠，推断Wistar大鼠对STZ敏感性高于SD大鼠，但其抵抗力低于SD大鼠。此仅为试验结果的初步推断，有研究亦提出造模时SD鼠可能优于Wistar鼠[14]。目前，很多研究使用Wistar鼠作为造糖尿病动物模型的实验对象，本试验与以往研究有差异，可能是例数不多或为偶发事件，需重复再研究。给药后的1周内应加强大鼠的饲养，勤换垫料，防止感染，尽量减少大鼠死亡。因试验条件原因，本试验没有比较不同剂量对SD大鼠造模情况的影响。
OGTT是在当血糖升高的程度未达到糖尿病诊断标准，不能确诊糖尿病而进行的一种进一步确诊糖尿病的检验措施。通过OGTT可以了解和观察糖代谢功能是否健全，对隐匿型糖尿病的诊断有重要意义[14]。可能因OGTT较花费时间，动物数量多时需耗较多人力物力，故试验中较少应用。比较空腹血糖值和OGTT异常阳性率发现，动物试验中空腹血糖值并不能很准确地反映出动物成模的真实情况，有的大鼠其空腹血糖值虽正常，但OGTT结果显示其糖耐量降低，说明其对葡萄糖的调节能力降低，实际上已造成了糖尿病模型，估计此类大鼠为糖尿病早期或亚临床型，故空腹血糖值未能体现出来。由此反映出在动物试验中，OGTT也比空腹血糖值有诊断意义，不易造成漏诊。若动物试验中用空腹血糖值作为判断成模标准得出的成模率不高时，建议可采用OGTT以减少漏诊，得出准确造模率，并减少实验动物的浪费。