摘 要：将羊种布鲁菌外膜蛋白25(OMP25)基因插入到山羊痘病毒转移载体PGM-TK-I1L-GPT1启动子I1L的下游，构建重组山羊痘病毒转移载体。用脂质体转染法将重组转移载体与山羊痘病毒疫苗株G14-STV44-55共转染绵羊成纤维细胞，在细胞内同源重组。通过霉酚酸药物筛选、纯化，经PCR鉴定获得了重组山羊痘病毒。
关键词：羊种布鲁菌；外膜蛋白25基因；重组山羊痘病毒
布鲁菌病(Brucellosis)是由布鲁菌(Brucella)感染引起的世界范围内的重要人畜共患传染病，牛、羊、猪等多种家畜和人均可感染。布鲁菌属有7个种20个生物型，感染人的有牛、羊、猪3个种。羊种布鲁菌在我国新疆、青海、内蒙等主要牧区的羊群流行日益严重。新疆建设兵团部分羊场、鹿场动物感染率持续出现增高，并有人感染的病例[1]。目前该病已经对这些地区的人畜健康造成了较大的危害。
疫苗接种是预防该病的有效手段，然而目前使用的布鲁菌疫苗M5，S2多是弱毒或中等毒力的活菌苗，免疫怀孕母畜后部分发生流产，有的甚至发生毒力返祖。为了提高疫苗的安全性，研究者们开展了布鲁菌基因工程疫苗的研究，特别是基因重组活载体苗。痘病毒是一种广泛使用的活载体，早在20世纪80年代后期欧洲等国就成功研制出以痘病毒为载体的狂犬病重组疫苗，并在野外成功应用，有效地控制这些地区的野生动物狂犬病[2]。但是由于痘病毒存在感染人及其多种动物的安全隐患，使人们对以其为载体的重组疫苗的安全性存在忧虑，因此逐渐开始转用宿主特异性更强的其他痘病毒如羊痘病毒。该病毒不感染人，宿主范围窄，包括牛、山羊、绵羊等，可作为这些动物致病原免疫基因良好的载体。牛瘟，小反刍兽疫和绵羊蓝舌病等的重组羊痘病毒载体疫苗已有研究成功的报道[3-6]。本研究通过克隆羊种布鲁菌外膜蛋白25基因(OMP25)片段，构建重组山羊痘病毒转移载体，转染绵羊成纤维细胞后，获得重组山羊痘病毒(recombinantGoatpoxvirus，RGPV)。
1 材料与方法
1.1 质粒、菌株、病毒和细胞
含有布鲁菌OMP25基因的质粒PBT-O25、大肠埃希菌工程菌TOP10由本室保存；表达布鲁菌OMP25基因的山羊痘病毒转移载体PGM-TK-I1L-GPT1由本室李有文构建；山羊痘病毒G14-STV44-55株，购自新疆天康生物制药厂；绵羊成纤维细胞由本室通过原代培养获得。
1.2 主要试剂
限制性内切酶、T4连接酶、Marker等为Promega公司产品；转染试剂购自Invitrogen公司；DMEM购自美国Invitrogen公司；选择培养基：DMEM加入20mL/L的小牛血清，100单位/mL的青链霉素，25 μg/mL的霉酚酸(MPA)，250 μg/mL的黄嘌呤，15μg/mL的次黄嘌呤，2 μg/mL的氨基喋呤和2 μg/mL的胸腺嘧啶；小牛血清购自民海生物公司。
1.3 PCR引物设计与合成
根据GenBank上公布的羊种布鲁菌OMP25基因序列设计一对引物P1和P2(划线部分是在5′末端和3′末端设计的相同的XhoⅠ酶切位点)。引物由三博远志公司合成。
P1：5′-CTCGAGATGCTCACACTCTTAAGTCTC-3′
P2：5′-CATCGGCTACAGTAAGTTCTAACTCTCGAG-3′
在测序后PGM-TK-I1L-GPT1载体的XhoⅠ酶切位点前后各100 bp处设计一对引物P3和P4，用于鉴定重组病毒。
P3：5′-AGCGGGTGGGTTTGGAA-3′
P4：5′-GGACCTATGTTTTCTGG-3′
1.4 含OMP25基因GPV转移载体的构建
以P1、P2引物扩增质粒PBT-O25中的OMP25基因，连接到PBS-T上，用XhoⅠ酶切回收642bp的片段。同时用XhoⅠ酶切回收PGM-TK-I1L-GPT1载体片段。将回收、纯化的OMP25基因插入到用相同酶切回收的质粒PGM-TK-I1L-GPT1中。PCR扩增及酶切后，测序鉴定OMP25基因的插入及方向。在所构建的质粒载体中，OMP25基因位于启动子I1L的下游，启动子的上游是鸟嘌呤核糖核酸转移酶基因(guanine-phosphoribosyltransferasegene，GPT)，为药物筛选标记。GPT-I1L启动子-OMP25基因位于GPV的胸苷激酶(thymidineKinase，TK)非必需区(图1)。
图1 转移载体PGM-TK-I1L-GPT1-O25的构建
Fig.1 The construction of transfer vector PGM-TK-I1L-GPT1-O25
1.5 RGPV的构建和筛选
RGPV的构建和筛选参考文献[7-8]进行。当绵羊成纤维细胞单层铺满80%左右后弃去培养液，用PBS液洗1次～2次，每瓶细胞接种0.5mL GPV ,37 ℃作用2 h。吸附完毕，弃去病毒液，用PBS液洗2次，通过脂质体转染方法将重组质粒转染该细胞，PBS洗涤1次，加入5 mL含20 mL/L胎牛血清的培养基。37 ℃，体积分数为5% CO2培养箱中培养3 d～7d，待细胞完全病变后，－20℃反复冻融，低速离心除去细胞碎片(上清可能含有重组病毒)。按10倍系列稀释，接种12孔细胞培养板，用选择培养基进行培养，筛选有病变的培养孔，连续传代和扩增培养数次，待出现稳定的病变后，收获重组病毒。
1.6 RGPV的PCR鉴定
将重组病毒接种绵羊成纤维细胞，待细胞出现病变后[9]，反复冻融3次～4次后收集，按照百泰克病毒DNA提取试剂盒的方法提取该病毒的DNA。用P3、P4引物扩增鉴定，若出现200bp左右的条带，则说明质粒没有重组进入病毒；若扩增出现850 bp左右的条带，则质粒成功重组进入病毒。
2 结果
2.1 OMP25基因的PCR扩增结果
以P1，P2引物PCR扩增质粒中的OMP25基因，扩增片段大小约为642 bp(图2)。
2.2 RGPV转移载体PGM-TK-I1L-GPT1-O25的酶切鉴定
用XhoⅠ限制性内切酶37 ℃消化PGM-TK-I1L-GPT1-O25质粒3 h，电泳后可见大小为642bp的片段，说明OMP25基因已成功连接到PGM-TK-I1L-GPT1载体上(图3)。
M.DNA标准Ⅱ；1,2.羊种布鲁菌OMP25基因；3.阴性对照
M.DNA MarkerⅡ；1,2.B.abortus OMP25 gene；3.Negative control
图2 羊种布鲁菌OMP25基因的PCR
Fig.2 PCR of B.abortus OMP25 gene
M.DNA标准Ⅲ；1,3.PGM-TK-I1L-GPT1-O25转移载体；2,4.PGM-TK-I1L-GPT1-O25转移载体XhoⅠ酶切
M.DNA MarkerⅢ；1,3.Transfer vector PGM-TK-I1L-GPT1-O25；2,4.XhoⅠdigestion of transfer vestor PGM-TK-I1L-GPT1-O25
图3 RGPV转移载体PGM-TK-I1L-GPT1-O25的酶切鉴定
Fig.3 Digestion of transfer vector PGM-TK-I1L-GPT1-O25
2.3 RGPV的构建和筛选
将转移载体PGM-TK-I1L-GPT1-O25通过脂质体的方法转染绵羊成纤维细胞，在选择培养基中培养，由于筛选液的作用，没有重组的病毒不能存活。4d后，细胞表现出痘病毒感染的早期病变，细胞相互融合，少量细胞肿胀，但不脱落。1周后，变圆细胞增多并成串脱落(图4)。
2.4 RGPV基因组中OMP25基因的PCR扩增结果
提取重组病毒接种绵羊成纤维细胞中的DNA ，用P1、P2引物进行PCR扩增，结果出现842bp片段，证明重组成功，即所构建的重组病毒中含有布鲁菌OMP25基因(图5)。
A.正常绵羊成纤维细胞；B.接入重组山羊痘病毒后产生的细胞病变效应
A.Normal sheep fibroblast；B.Cytopathic effect (CPE) in cellsinfected with RGPV
图4 绵羊成纤维细胞的病理变化
Fig.4 Pathological lesion of Sheep fibroblast
1.阴性对照；2.重组山羊痘病毒；3.由山羊痘病毒；M.DNA标准Ⅲ
1.Negative control；2.RGPV；3.GPV；M.DNA MarkerⅢ
图5 RGPV PCR鉴定
Fig.5 Detection of RGPV by PCR
3 讨论
利用报告基因是筛选、鉴定和纯化重组病毒的一个重要手段。本研究中应用的是具有新霉素抗性的基因-GPT基因作为报告基因[10]，它是一种哺乳动物细胞筛选标记基因，比较容易得到纯化的重组病毒。霉酚酸能强烈抑制肌苷酸脱氢酶导致嘌呤合成的阻断，从而抑制痘病毒在大多数细胞中的复制。但是需要注意的是，霉酚酸容易失效而导致筛选出现假阳性结果。理论上转染的产物接种筛选液，只要出现CPE就应该是重组病毒，但是试验中却在筛选的CPE明显的培养物中检测到重组阴性结果。虽然还加了氨基喋呤抑制剂，这可能与霉酚酸的纯度有关，或是反复冻融引起试剂失效。在确保霉酚酸质量的前提下，一般需传3代～4代就可得到纯化的重组病毒。
转染是影响重组病毒载体构建的重要因素。在转染过程中需要注意以下几点：①用于转染的细胞生长状态必须良好，一般长成60%～80%的单层即可。若使用原代细胞，以前5代为宜。收毒时间大约转染后24h～48h。②转移载体质粒最好是新鲜提取的，并且用无内毒素的超螺旋质粒提取试剂盒提取；③转移质粒的浓度与转染试剂的比例也是影响转染的一个重要原因；④各生产厂家的转染试剂操作与要求不尽相同，所以具体操作以厂商提供的说明书为准。另外，转染试剂对细胞有一定毒害作用，影响细胞生长，所以转染后应及时更换培养液。
本研究将羊种布鲁菌OMP25基因扩增插入到PGM-TK-I1L-GPT1质粒中，与山羊痘疫苗株同源重组后得到了RGPV。经PCR鉴定和序列测定，表明布鲁菌OMP25基因已成功插入到羊痘病毒基因组中，为进一步研究重组山羊痘免疫原性奠定了基础。