摘 要：从广西病猪的肺组织中分离到猪巨细胞病毒株，通过扩增得到猪巨细胞病毒株基因的一个片段，扩增产物经克隆、测序，得到的核苷酸序列与上已发表的猪巨细胞病毒其他分离株的核苷酸序列相比，其同源性在～，与人巨细胞病毒分离株的同源性在～，表明基因在同种动物间比较保守。在系统进化树中，株与其他猪巨化细胞病毒株亲缘关系较近，属于同一个分支，而与人巨化细胞病毒差异较大。关键词：猪巨细胞病毒；基因；克隆；序列分析猪巨细胞病毒(Porcinecytomegalovirus，PCMV)属β疱疹病毒亚科。该病毒首次从英格兰分离获得疱疹样病毒粒子，是继伪狂犬病病毒之后发现的第2个猪疱疹病毒[1]。PCMV主要是一种“机会性感染”的病毒，多呈隐性感染，潜伏感染状态的猪在长途运输、寒冷、分娩等应激因素作用下，病毒可被激活并重新排毒。用不带毒的3周龄～5周龄猪的肺泡巨噬细胞进行培养，可100%地分离出PCMV[2-3]。2007年12月作者从广西病猪的肺组织中分离到1株猪巨细胞病毒GX株，通过对猪巨细胞病毒gB基因进行克隆与序列分析，为以后对该病毒的进一步研究奠定了基础。
1 材料与方法
病毒来源诊断为猪巨细胞病毒感染的病猪肺组织。
引物的设计与合成根据GenBank发表的PCMV的AF268039序列，通过Oligo软件分析猪巨细胞病毒gB基因序列设计1对引物：
上游引物gB1：5′-TATGTTTGCGGTCTCTTGT-3′；下游引物gB2：5′-TGACCCGTAAATTGTTGA-3′，由宝生物工程(大连)有限公司合成。
主要试剂dNTP、TaqDNA聚合酶、蛋白酶K、DNA Marker DL 2 000、SDS、Tris饱和酚、氯仿等均购自宝生物工程(大连)有限公司。
抽提取病料组织悬液1.0 mL,10 000 r/min离心5 min，弃上清，加入200 μL的PBS液、160μL的EDTA混匀，再加入80 μL 100 mL/L SDS和10 μL(10 mg/mL)的蛋白酶K，混匀后52℃水浴2h。酚氯仿抽提2次，加入2倍体积无水乙醇及100 mL/L醋酸钠，－20 ℃沉淀2h,12 000 r/min离心15min，700 mL/L乙醇洗涤2次，烘干后加入50 μL ddH2O即为模板，置－20 ℃保存备用。
基因片段扩增反应体系为25μL，取模板2.0 μL，加10×Reaction buffer 2.5 μL，dNTP(2.5mmol/L)2.0 μL，引物gB1(25 pmol/μL)0.5 μL，引物gB2(25 pmol/μL)0.5 μL，MgCl2(25 mmol/L) 2.0 μL，TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL，ddH2O 15.5 μL，置PCR仪中扩增：95 ℃ 4 min；94 ℃ 60 s，58 ℃60 s,72℃ 60 s,34个循环；72℃ 5 min。
电泳取PCR产物5 μL在10 g/L琼脂糖凝胶上电泳，置凝胶成像系统中观察结果。
产物胶回收、连接、酶切鉴定及测序回收PCR产物中1 700bp大小的DNA片段，回收目的DNA按连接试剂盒说明书进行连接，然后将连接产物转化到感受态细胞DH5α中，涂平板，培养24h，挑斑接种到LB液体培养基中，置37℃摇床培养16 h；取1.0mL培养物抽提重组质粒，进行酶切及PCR鉴定，将阳性菌株送宝生物工程(大连)有限公司进行测序。将测序结果与已发表的基因序列利用DNAStar软件进行核苷酸同源性分析，并构建出进化树。
2 结果
基因的扩增结果利用猪巨细胞病毒gB基因的特异性引物扩增出长度约为1 736 bp的条带，与设计的长度一致(图1)。
重组质粒的酶切鉴定胶回收产物经EcoRⅠ和PstⅠ进行酶切鉴定，结果分别切出约为2 650 bp、1 736 bp的预期条带(图2)，说明鉴定的重组质粒为阳性。
猪巨细胞病毒基因序列测定猪巨细胞病毒gB基因GX株的测序结果以及推导的氨基酸序列见图3，克隆获得gB基因1 736 bp，ORF为1710个碱基，编码570个氨基酸。
猪巨细胞病毒基因核苷酸序列同源性分析GX株gB基因核苷酸序列与GenBank已发表的猪巨细胞病毒gB基因核苷酸的同源性均在97.8%以上，氨基酸同源性均在97.4%以上；但与人巨细胞病毒gB基因差别很大，核苷酸同源性在43.6%以下，氨基酸同源性在37.5%以下，表1左下方为氨基酸序列同源性，右上方为核苷酸序列同源性。1～10分别为AF268039、AF268040，AF268041、AF394056、AF394057、GXgB、HCU66425、HS5GLYBE、HS5GLYBG、HS5GLYBI。
进化树分析由DNAStar软件构建进化树，结果见图4。遗传进化分析结果表明，猪巨化细胞病毒变异很小，不同来源的毒株都源于同一起源，但与人细胞巨化病毒差异较大。
M.DNA标准DL 2 000；1.gB基因PCR产物
M.DNA Marker DL 2 000；1.PCR products of gB gene
图1 gB基因的PCR产物
Fig.1 PCR products of gB gene
M.DNA标准DL 2 000；1.质粒双酶切
M.DNA Marker DL 2 000；1.Plasmid digested byEcoRⅠ andPstⅠ
图2 gB基因重组质粒酶切鉴定结果
Fig.2 Recombinant plasmid of gB gene digested with restrictionenzymes
表1 PCMV和HCMV的gB基因核苷酸和氨基酸序列同源性比较
Table 1 Homological comparison of nucleotide and amino acidsequence of gB gene of PCMV and HCMV
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
1 | 97.8 | 97.9 | 97.9 | 99.9 | 98.9 | |
2 | 96.8 | 99.1 | 99.3 | 98.0 | 97.8 | |
3 | 97.0 | 98.9 | 99.2 | 98.0 | 97.8 | |
4 | 97.2 | 99.3 | 98.9 | 98.0 | 97.8 | |
5 | 99.8 | 96.7 | 96.8 | 97.0 | 98.8 | |
6 | 98.8 | 97.4 | 97.7 | 97.7 | 98.6 | |
7 | 36.3 | 34.5 | 35.9 | 36.1 | 36.1 | 36.3 |
8 | 36.5 | 36.3 | 36.3 | 36.4 | 36.3 | 36.5 |
9 | 37.5 | 34.7 | 36.1 | 36.3 | 37.4 | 37.5 |
10 | 36.3 | 36.1 | 36.1 | 36.1 | 36.1 | 36.3 |
图3 GX分离株gB基因测序结果以及推导的氨基酸序列
Fig.3 Nucleotide sequence and predicted amino acid sequence of gBgene of GX strain
图4 GX分离株gB基因进化树
Fig.4 The phylogenetic tree of gB gene of GX strain
3 讨论
猪巨细胞病毒在形态上属于典型的疱疹双链DNA病毒，中央为电子致密的芯髓，芯髓常为卵圆形，也有长方形到哑铃状，其直径为45 nm～70nm。在芯髓外围为正20面体核衣壳，其直径约80 nm～100nm，最外围为囊膜，多为单层，偶尔也有双层，有囊膜的病毒颗粒直径为120 nm～150nm，囊膜上还有纤突，核衣壳与囊膜之间似乎有一圈半透明带包围着电子致密外套相分隔[4-5]。其gB蛋白是PCMV重要跨膜糖蛋白，在病毒与机体细胞膜的黏附、融合及病毒进入细胞和在细胞间的转移起作用[6]；gB蛋白具有较好的免疫原性[7]，可诱导机体产生抗CMV的特异性免疫应答[8-9]。本研究对国内分离的PCMV的gB基因进行了克隆、测序，通过同源性比较[10-11]，猪巨细胞病毒GX株与GenBank上传的其它猪巨化细胞病毒相关序列同源性在97.8%～99.9%之间，推导的氨基酸序列同源性在97.0%～99.8%之间，同源性非常高，而与人巨化细胞病毒的同源性较低，说明该基因相当保守，且具有一定的特异性。