摘 要：根据公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒株基因的核苷酸序列设计一对特异性引物，用扩增蛋白非中和性表位缺失的基因，将基因定向连接在真核表达载体的和多克隆位点之间，构建重组质粒。转化感受态大肠埃希菌，提取质粒。重组质粒经、双酶切鉴定及序列测定，成功构建了基因的重组体。关键词：；非中和表位；；猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductive and respiratory syndromevirus，PRRSV)是危害世界养猪业的重要病原之一，可引起持续感染。免疫接种是预防该病的主要措施，但现有的商品化疫苗(弱毒苗和灭活苗)均存在一定程度的缺陷。其中弱毒苗虽然免疫效果好，但存在散毒和返强的危险性，灭活苗与弱毒苗相比，虽然安全性好，但产生的保护力不强，需要反复多次的免疫接种，且效果不稳定，经常出现免疫失败[1]。新的流行毒株的威胁将持续存在，故探索新型防控技术十分必要。
PRRSV的主要中和位点位于GP5蛋白[2-3]。GP5蛋白含有多个中和表位，用重组GP5蛋白制备的单克隆抗体具有中和活性。Ostrouski M等[4]在采用噬菌体表面展示技术确定GP5中和表位时，发现与中和表位紧邻的上游存在一个非中和表位，该表位具有类似于人类免疫缺陷病毒(HIV)中覆盖表位的覆盖效应，也正是这一覆盖表位的覆盖效应[5]，导致GP5中和表位无法充分暴露，从而难以激发很强的中和抗体。
本研究通过PCR扩增GP5非中和性表位缺失(N端36AA缺失)的tGP5序列，然后克隆到真核表达载体pcDNA3.1中，目的是构建重组质粒pcDNA3.1-tGP5，为以后研究GP5非中和性表位对中和表位的影响奠定基础。
1 材料与方法
试剂DNA Marker、TaqDNAPloymerase、HindⅢ、EcoRⅠ限制性内切酶和dNTP混合物购自北京赛百盛基因技术有限公司；胶回收试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；琼脂糖购自美国Sigma公司；酚、氯仿购自上海博亚生物技术有限公司；DH5α、pcDNA3.1、pcDNA3.1-GP5为青岛农业大学动物医学院实验室保存。其余试剂均为分析纯。
引物根据GenBank发表的PRRSVS1株ORF5基因阅读框序列，同时考虑pcDNA3.1多克隆位点和外源基因的表达量在基因起始密码子前面加入Kozak序列，设计了针对去除GP5非中和性表位36个氨基酸的一对引物tGP5.1：5′-AACAAGCTTGCC ATGTCC CAT CTA CAG CTG ATT TAC；tGP5.2：5′-ATCGAA TTCCTAAGGACG ACC CCA TTG TTC CGC。
基因的扩增以pcDNA3.1-GP5为模板进行tGP5基因的扩增，扩增条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s,66 ℃30 s,72 ℃ 40 s，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min。
真核表达载体的构建将tGP5 PCR产物和pcDNA3.1经EcoRⅠ和HindⅢ 37 ℃双酶切3h，酶切产物经电泳鉴定并切胶回收(按照胶回收试剂盒说明书进行)。将回收的tGP5和pcDNA3.1双酶切产物用T4连接酶连接，16℃过夜。连接产物转化感受态细胞DH5α，按照常规方法小量提取质粒。
真核表达载体鉴定将提取的质粒经PCR、双酶切和测序鉴定。
2 结果
重组质粒扩增产物电泳结果pcDNA3.1-tGP5真核表达载体经PCR扩增得到目的条带522 bp(图1)。
1.DNA标准DL 2 000；2～3.pcDNA3.1-tGP5 PCR产物；4.空白对照
1.DNA Marker DL 2 000；2-3.pcDNA3.1-tGP5 PCR product；4.Negativecontrol
图1 pcDNA3.1-tGP5真核表达载体的PCR鉴定
Fig.1 PCR Amplification of tGP5 gene ofpcDNA3.1-tGP 真核表达载体双酶切鉴定pcDNA3.1-tGP5真核表达载体经双酶切，切出1条约500bp目的条带，而阴性对照则无目的条带。
1.DNA标准DL 2 000；2～3.pcDNA3.1-tGP5双酶切；4～5.pcDNA3.1双酶切；6.DNA标准DL 6000
1.DNA Marker DL 2 000；2-3.pcDNA3.1-tGP5EcoRⅠ/HindⅢ double digestion；4-5.pcDNA3.1EcoRⅠ/HindⅢ double digestion；6.DNA Marker DL 6 000
图2 pcDNA3.1-tGP5真核表达载体双酶切鉴定
Fig.2 Endonuclease digestion analysis of pcDNA3.1-tGP
真核表达载体测序结果将含有真核表达载体的菌液送宝生物工程(大
连)有限公司测序，序列分析与预期序列的同源性为99.6%，表明pcDNA3.1-tGP5真核表达载体成功构建。
3 讨论
针对PRRSV传统疫苗存在诸多缺陷，研制安全有效的新型疫苗已经成为当前的重要课题。研究证明，PRRSVGP5蛋白能在猪体内诱导产生中和抗体，GP5蛋白基因已成为研制新型疫苗良好的候选材料。在接毒后早期(7 d～9d)能检测到强抗体反应，这种血清反应可通过间接荧光抗体反应检测到[6]。然而，这种早期产生的抗体在体外不能中和PRRSV[7]。具有中和活性的PRRSV抗体只出现在感染后期[8]。早期明显的PRRSV和抗PRRSV特异性抗体同时存在于循环体系中，说明早期产生的抗体没有能力保护机体不受PRRSV感染。从国内外有关PRRSVDNA疫苗(主要是ORF5基因)研究结果看，普遍存在难以诱发较早和较高的抗体水平[9-10]。Ostrouski M等[4]在采用噬菌体表面展示技术确定GP5中和表位时，发现与中和表位紧邻的上游存在一个非中和表位，此表位可能具有类似于HIV中覆盖表位的覆盖效应，这可能是ORF5DNA疫苗难以诱发较高的中和抗体的原因。本研究构建的pcDNA3.1-tGP5，可以明显缩短机体产生抗PRRSV中和抗体的时间。研究通过PCR扩增GP5非中和性表位缺失(N端36AA缺失)的tGP5序列，然后克隆到真核表达载体pcDNA3.1中，成功构建重组质粒pcDNA3.1-tGP5，为今后研究GP5非中和性表位对中和表位的影响奠定了基础。