辽宁省地方标准 DB 21、T2325-2014
1 范围
本标准规定了猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus，TGEV）RT-PCR检测方法的技术要求。
本标准适用于猪传染性胃肠炎的诊断和监测，适用于猪肠内容物、粪便以及细胞培养物中TGEV核酸的检测。
本标准中的试验操作应在生物安全Ⅱ级（BSL-2）以上的实验室进行。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
兽医实验室生物安全技术管理规范
3 缩略语
下列缩略语适用于本标准。
TGEV：猪传染性胃肠炎病毒（DEPC：焦炭酸二乙酯（diethylpyrocarbonate）
RNA：核糖核酸（ribonucleic acid）
DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid）
bp：碱基对（base pair）
RT-PCR：反转录聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction）
Taq酶：HS Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase）
dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate）
AMV：鸟类成髓细胞白血病病毒（avian myeloblastosis virus）
PBS：磷酸缓冲液（phosphate buffer solution）
TAE：Tris-乙酸电泳缓冲液（tris acetate-EDTA buffer）
4 原理
TGEV是一种RNA病毒。RNA反转录产生的cDNA可作为PCR模板进行扩增。根据PEDV保守基因序列设计一对引物，在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以引物为延伸起点，通过变性、退火和延伸，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA。
5 仪器和器材
本技术规范中需使用的主要仪器和器材有高速台式冷冻离心机（最大离心力12 000 g以上）、冰箱（2~8℃，-20℃和-70℃三种）、PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像系统、微波炉、分析天平、1.5 mL离心管、0.2 mL离心管、微量移液器和吸头。
6 试剂和材料
6.1 Trizol：RNA抽提试剂，外观为粉红色，分装至棕色瓶中，于4～8 ℃保存。
6.2 氯仿：4 ℃预冷。
6.3 异丙醇：4 ℃预冷。
6.4 75%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，-20 ℃预冷。
6.5 DEPC水：去离子水中加入0.1% DEPC，37℃作用1 h，121（±2）℃，高压灭菌15 min。
6.6 RNA酶抑制剂（40 U/μL）。
6.7 DNA聚合酶：HS Taq DNA聚合酶（5 U/μL）。
6.8 dNTP（10 mmol/L）。
6.9 用于RT-PCR反应的引物浓度为20 μmol/L，其序列如下：
上游引物F：5′- GTGGTCGGAAGAGTAATAACATAC -3′
下游引物R：5′- CAACCCAGACAACTCCATCTA -3′
6.10 反转录酶：AMV反转录酶（5 U/μL）。
6.11 反转录引物：Oligo dT-Adaptor Primer（2.5 μmol/L）。
6.12 阴性对照：DEPC水。
6.13 阳性对照：TGEV细胞培养物。
6.14 PBS：磷酸盐缓冲液（0.02 mol/L pH7.2）。
6.15 TAE：三羟甲基氨基甲烷一乙酸电泳缓冲液。
6.16 溴化乙锭。
6.17 DL2000 DNA Marker。
注：除另有说明，所用试剂均为分析纯；所有试剂均用无RNA酶的容器分装。
7 操作步骤
7.1 样品的采集、前处理、存放和运送
7.1.1 采样注意事项
采样及样品前处理过程中应戴一次性手套，样本间不得交叉污染。
7.1.2 采样工具
药匙、15 mL离心管和1.5 mL离心管经121（±2）℃ 高压灭菌15 min；剪刀、镊子经160 ℃干热灭菌2 h。
7.1.3 肠内容物的采集与前处理
采取病死或剖杀猪的小肠内容物，装入15 mL灭菌离心管中，按1：5倍体积加入PBS（见附录A），混匀，3000 rpm离心20 min，取上清液转入1.5 mL离心管中编号备用，待检。
7.1.4 粪便的采集与前处理
用药匙采取发病猪新鲜粪便，装入15 mL灭菌离心管中，按1：5倍体积加入PBS（见附录A），混匀，3000 rpm离心20 min，取上清液转入1.5 mL离心管中编号备用，待检。
7.1.5 细胞培养物
细胞培养物冻融3次，转入1.5 mL离心管中编号备用。
7.1.6 存放与运送
采集或处理的样品在2~8 ℃条件下保存应不超过24 h；若需长期保存，应放置-70 ℃冰箱，但应避免反复冻融（冻融不超过3次）。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，在6~8 h之内运送到实验室。按照《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品的生物安全标识。
7.2 RT-PCR检测
7.2.1 RNA提取
在核酸提取室进行。
7.2.1.1 取n个灭菌的1.5 mL离心管，其中n为待检样品数+阳性对照管数+阴性对照管数，对每个离心管进行编号。
7.2.1.2 每管加入750 μL Trizol，分别加入被检样品、阳性对照和阴性对照各250 μL，颠倒10次混匀，室温静置5 min；再加入250 μL氯仿，混匀器上振荡混匀15 s（也可以用手反复颠倒混匀）。4 ℃ 12000g离心15 min。
7.2.1.3 取与7.1.1中相同数量灭菌的1.5 mL离心管，加入500 μL异丙醇(4 ℃预冷)。取7.1.2中离心后的上清液约500 μL转移至相应的管中，颠倒混匀，室温静置15 min。
7.2.1.4 4 ℃ 12000 g离心15 min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体，加入1 mL 75%乙醇。
7.2.1.5 4 ℃ 12000 g离心10 min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体。
7.2.1.6 4000 g离心10 s，用微量加样器小心将残余液体吸干，室温干燥3~10 min。
7.2.1.7 加入18 μL经DEPC处理的水和2 μL RNA酶抑制剂，轻柔混匀，溶解管壁上的RNA，冰上保存备用。提取的RNA应在2 h内进行RT-PCR扩增；于-70 ℃冰箱长期保存。
7.2.2 反转录
7.2.2.1 反转录体系
建立10 μL的反应体系，按下列组分加入离心管中：
MgCl2 2 μL
10×RT Buffer 1 μL
RNase Free dH2O 2.75 μL
dNTP Mixture(各10mM) 1 μL
RNase Inhibitor 0.25 μL
AMV Reverse Transcriptase*1 0.5 μL
Oligo dT-Adaptor Primer 0.5 μL
实验样品RNA 2 μL
7.2.2.2 反转录条件
42 ℃ 1 h；95 ℃ 5 min；5 ℃ 5 min。
7.2.3 PCR
7.2.3.1 PCR反应体系
建立50 μL的反应体系，按下列组分加入PCR专用离心管中：
5×PCR Buffer 10 μL
灭菌蒸馏水 27.75 μL
HS Taq DNA聚合酶 0.25 μL
上游特异性PCR引物 1 μL
下游特异性PCR引物 1 μL
反转录产物 10 μL
7.2.3.2 PCR反应条件
94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35个循环；72 ℃终延伸10 min。
7.2.3.3 电泳
将PCR扩增产物6μL与1μL上样缓冲液混合，点样于1.2%琼脂糖凝胶（见附录A）板加样孔中，琼脂糖凝胶板一侧点样孔加入DL2000 DNA Marker（分子质量标准物），缓冲液为1×TAE，以5 V/cm电压电泳25 min。
8 结果判定
紫外凝胶成像仪下观察结果，当阳性对照出现在276 bp扩增条带，阴性对照未出现目的条带时，实验结果可作为判定依据。被检样品出现276 bp扩增条带为TGEV核酸阳性，未出现276 bp扩增条带的样品判为TGEV核酸阴性。
图注：
M—DL2000 DNA Marker，N—阴性对照，P—阳性对照，1、3、5—阳性样品，2、4—阴性样品
图1 PCR扩增产物电泳检测结果
