辽宁省地方标准 DB 21/T2326-2014
1 范围
本标准规定了猪伪狂犬病毒（pseudorabies virus，PRV）gG和gE基因的荧光PCR检测方法的实验技术要求。
本标准适用于PRV的诊断、监测及流行病学调查，适用于猪脏器、血液和细胞培养物中PRV核酸的检测，以及根据免疫背景对gE基因缺失疫苗毒与野毒感染的鉴别检测。
本标准中的试验操作应在生物安全Ⅱ级（BSL-2）以上的实验室进行。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
兽医实验室生物安全技术管理规范
3 缩略语
下列缩略语适用于本标准。
PRV：猪伪狂犬病毒（pseudorabies virus）
HS Taq酶：热启动Taq DNA聚合酶(HS Taq DNA polymerase)
Ct值：达到阈值的循环数(cycle threshold)
DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)
荧光PCR：荧光聚合酶链式反应( real time fluozescent quantitative polymerase chain reaction)
PBS：磷酸缓冲液（phosphate buffer solution）
4 原理
SYBR? GreenⅠ是荧光定量PCR最常用的DNA结合染料，能与通过PCR反应产生的双链DNA非特异性结合，结合后发出荧光，通过检测反应体系中SYBR? GreenⅠ荧光强度，同时测定扩增产物DNA的熔解温度，分析PCR扩增产物的单一性，以达到检测PCR产物扩增量的目的。
5 仪器和器材
5.1 仪器
分析天平、高速离心机、荧光PCR扩增仪、-70℃冰箱、-20℃冰箱、水浴锅、可调移液器（最大量程为2μL，20μL，200μL，1000μL）。
5.2 器材
组织匀浆器或研钵、眼科剪、眼科镊、10 mL一次性注射器、1.5 mL灭菌离心管、PCR八联排管或96孔板、吸头（10μL，200μL，1000μL）、灭菌双蒸水、称量纸。
6 试剂和材料
6.1 DNAzol? Reagent：DNA抽提试剂，外观为淡绿色，于4 ~8 ℃保存。
6.2 SYBR? Premix Ex TaqTM Ⅱ（Perfect Real Time）：SYBR? GreenⅠ嵌合荧光法进行Real Time PCR反应的专用试剂，为PCR Buffer、dNTP、RNaseH、HS Taq酶以及SYBR? GreenⅠ染料的预混液，于-20℃长期保存，融化后于4 ℃～8 ℃保存。
6.3 PBS：磷酸盐缓冲液（0.02 mol/L pH7.2）。
6.4 无水乙醇：-20℃预冷。
6.5 75%乙醇：用无水乙醇和灭菌双蒸水配制，-20℃预冷。
6.6 阴性对照：灭菌双蒸水。
6.7 阳性对照：PRV细胞培养物。
注：本标准所用试剂，除特殊标注外，均为分析纯。
7 操作步骤
7.1 样品的采集、前处理、存放和运送
7.1.1 采样注意事项
采样及样品前处理过程中应戴一次性手套，样本间不得交叉污染。
7.1.2 采样工具
药匙、15 mL离心管和1.5 mL离心管经121（±2）℃高压灭菌15 min；剪刀、镊子经160 ℃干热灭菌2 h。
7.1.3 内脏样品的采集与前处理
采取病死或剖杀猪主要脏器（脑、淋巴结、脾脏、肺脏、肾脏）装入灭菌15 mL离心管中，编号，送实验室。取100 mg左右待检样品，按1:5倍体积加入PBS，于研钵或组织匀浆器中充分研磨，1 000 g离心15 min，取上清液，转入1.5 mL离心管中编号备用。
7.1.4 血液样品的采集与处理
用无菌注射器采集血液，注入含1/10 4% EDTA溶液的无菌容器中，充分混匀，编号备用。
7.1.5 细胞培养物
细胞培养物冻融3次，转入1.5 mL离心管中编号备用。
7.1.6 存放与运送
采集或处理的样品在2~8 ℃条件下保存应不超过24 h；若需长期保存，应放置-70 ℃冰箱，但应避免反复冻融（冻融不超过3次）。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，在6~8 h之内运送到实验室。按照《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品的生物安全标识。
7.2 实时荧光PCR检测
7.2.1 DNA提取
在核酸提取室进行。
7.2.1.1 取n个灭菌的1.5 mL离心管，其中n为待检样品数+阳性对照+阴性对照，对每个离心管进行编号。
7.2.1.2 每管加入800 μL DNAzol，分别加入被检样品、阳性对照、阴性对照各200 μL，颠倒10次混匀，室温静置5 min；4℃ 10 000 g离心10 min。
7.2.1.3 取900μL上清，置新的1.5mL灭菌离心管中，加入500 μL无水乙醇，混匀，室温放置3 min；4℃ 10 000 g离心5min。
7.2.1.4 弃上清，沿管壁缓缓加入1mL 75%乙醇，混匀，4℃ 10 000 g离心5min。反复洗涤两次后，将离心管倒扣于吸水纸上，自然晾干（以无乙醇味为准）。
7.2.1.5 用20 ?L灭菌双蒸水溶解沉淀，于-20 ℃冰箱保存备用。
7.2.2 扩增体系的配制
在配液区进行。
配制gE基因扩增反应液，设实时荧光PCR反应数为n，其中n为待检样品数+阳性管数+阴性管数，每个样本检测反应体系配制见表1，向每个荧光PCR管或孔中分装23?L的反应体系。gG基因扩增反应液配制方法同gE基因。
表1 每个样品反应体系配制表
体系组分 | 用量 | 终浓度 | 备注 |
SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（2×） | 12.5?L | 1× | |
上游引物F | 0.25?L | 0.2μmol/L | |
下游引物R | 0.25?L | 0.2μmol/L | |
ROX Reference Dye（50×） | 0.5?L | 1× | 仅使用在ABI、Stratagene等公司的荧光PCR扩增仪上 |
灭菌双蒸水 | 10?L/9.5?L | — | |
总量 | 23?L | — |
7.2.3 加样
在样本处理区进行。
在各设定的荧光PCR管中加入7.2.1中制备的2 ?L DNA溶液。盖紧管盖，除气泡、离心。
7.2.4 荧光PCR扩增检测
在扩增室进行。
7.2.4.1 将7.2.3中离心后的PCR管放入荧光PCR扩增仪内，注意检查各反应管是否盖紧，记录样品摆放次序。
7.2.4.2 gE和gG基因扩增反应条件均为：95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 30s，40个循环。荧光信号收集设置在每次循环的退火延伸时进行；在扩增反应结束后，分析熔解曲线。
8 结果判定
8.1 阈值设定
试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值直接读取检测结果，Ct值为每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
8.2 质控标准
8.2.1 阴性对照无Ct值，且无典型扩增曲线；或阴性对照Ct值>35.0，出现扩增曲线，但gE基因熔解曲线于88℃左右未出现明显的峰值，gG基因熔解曲线于84℃左右未出现明显的峰值。
8.2.2 阳性对照Ct值<30.0，并出现典型的扩增曲线，gE基因熔解曲线于88℃左右出现明显的峰值，gG基因熔解曲线于84℃左右出现明显的峰值。否则，此次试验视为无效.
8.3 结果描述及判定
8.3.1 gE基因
8.3.1.1 阴性
无Ct值并且无典型的扩增曲线；或阴性对照Ct值>35.0，出现扩增曲线，但gE基因熔解曲线于88℃左右未出现明显的峰值，表示样品中无PRV核酸。
8.3.1.2 阳性
Ct值≦35.0，出现典型的扩增曲线，且gE基因熔解曲线于88℃左右出现明显的峰值，表示样品中存在PRV核酸。
8.3.1.3 可疑
30.0＜Ct值＜35.0，且出现扩增曲线的样本判定为可疑。可疑样本进行双孔重复试验，若任一孔或两孔重复试验结果为阳性者判为阳性，否则为阴性。
8.3.2 gG基因
8.3.2.1 阴性
无Ct值并且无典型的扩增曲线；或阴性对照Ct值>35.0，出现扩增曲线，但gG基因熔解曲线于84℃左右未出现明显的峰值，表示样品中无PRV核酸。
8.3.2.2 阳性
Ct值≦35.0，出现典型的扩增曲线，且gG基因熔解曲线于84℃左右出现明显的峰值，表示样品中存在PRV核酸。
8.3.2.3 可疑
30.0＜Ct值＜35.0，且出现扩增曲线的样本判定为可疑。可疑样本进行双孔重复试验，若任一孔或两孔重复试验结果为阳性者判为阳性，否则为阴性。
8.4 鉴别检测
针对免疫gE基因缺失活疫苗猪群，gE基因及gG基因均阳性，表示有野毒感染；gE基因阴性，而gG基因阳性，为苗源病毒。
