伴随着遗传学理论的不断发展，牛的育种技术经历了表型选择 → 育种值选择 → 基因型选择的过程。基因型选择是通过确定性状所对应的基因型进行选择，即分子育种 (Molecular Breeding) 。狭义的分子育种技术仅指 DNA 改组，广义的分子育种技术则包括 DNA 改组、 DNA 改组的改良和基因组新技术等内容 [1] 。分子育种技术从一诞生就受到科学家的极大关注，现已广泛应用于医学、农学等各个领域的研究，特别在奶牛业上发展迅速，收到了良好的效果。目前已针对牛的不同经济性状和繁殖性状等主要性状提出了不同的研究方案。从当前的发展情况来看，牛分子育种的研究主要以分子标记为基础进行标记辅助选择 ( 即主效数量性状基因座育种 ) ，然后以转基因技术为基础进行转基因育种。本文就分子育种的理论基础 —— 功能基因组学的研究、国内外现代牛分子育种的研究现状及其发展趋势作以综述。
• 功能基因组学研究
随着 DNA 双螺旋结构发现 50 周年、人类基因组计划的提前完成和美国国家人类基因组研究中心今后工作目标的公布 [2] 。人们对于基因组学的研究从结构基因组学发展到功能基因组学。功能基因组学通过表达序列标 (EST) 、基因表达序列分析 (SAGE) 、 DNA 芯片技术、蛋白质组 (Proteome) 技术、反向遗传学 (Reverse genetics) 和生物信息学 (Bioinformatics) 技术等在基因组水平上系统、全面的分析基因功能。这些技术各有优点，如 EST 可提供连锁图谱中的信息位点； SAGE 可定量研究不同细胞、不同发育阶段、不同进化程度及不同生理病理状态下基因表达的差异。近年来，随着基因组研究的快速发展，动物基因组计划紧随人类基因组计划也开始全面展开 [3] 。畜禽功能基因组学研究能快速准确的分离得到同表型相联系的侯选基因，为畜禽分子育种奠定了理论基石，对控制畜禽重要经济性状的基因座及性状形成机理的研究起了推动作用 [4] 。
• 国内外牛分子育种的研究现状
• 主效数量性状基因座育种
主效 QTL 育种即定位牛 QTL 位点中主效基因并直接进行改良或发现与之相连的 DNA 标记进行标记辅助选择 (Marker Assistant Selection, MAS) 。牛由于低遗传力，用传统的表型选择来提高性状很困难，现大量的研究着手于不同品种的重要性状 QTL 图谱的建立和分子遗传标记的鉴定 [5] 。
• 牛的重要性状基因定位
基因定位 (Gene Mapping) 是将基因定位于某一染色体特定的区段，并测定基因在染色体上线性排列的顺序与相互之间的距离。牛基因定位的研究内容包括如下两大方面：构建牛遗传图谱 (Genetic Map) 和牛物理图谱 (Physical Map) 。牛遗传图谱主要用来分析牛重要经济性状在基因组中的位置及其对表型性状的贡献率 , 是定位重要生产性状基因和 MAS 的基础。通过重组率来计算和表示，以厘摩 (cM) 为单位，两个遗传座位间 1% 的重组率即为 1cM , 牛的全基因组长约为 3000cM 。牛物理图谱则标明了基因座在染色体上的精确位置，是位置克隆和体外操作重要经济性状基因的指南。以图谱为基础的克隆和 QTL 等位基因的鉴别需将连锁图谱和物理图谱中的基因位点结合到一起来应用。
牛第一张微卫星标记遗传连锁图谱由 Barendse 于 1994 年建成 [6] ，第一代牛全基因组遗传图谱包括 Bishop (1994) 、 Barendse(1994) 、 Georges(1995) 和 Ma(1996) 发表的 4 张图谱。其中美国农业部的肉用动物研究中心 (MARC) 构建的连锁图谱包含 313 个标记，跨距 2464cM 。第二代全基因组遗传连锁图谱是 1997 年，美国 MARC 和澳大利亚联邦科学与工业研究组织又分别发表了牛的第二代连锁图谱。前者构建图谱共有 1236 个标记，图谱总长 2990cM ，覆盖 2 条性染色体和 29 条常染色体，标记间平均间距为 2.5cM [7] ；后者构建的是一个中等标记密度的标记图谱，包括 746 个 DNA 多态性标记，其中 703 个标记位点都有相连锁的标记位点，覆盖 95% 基因组 [8] 。同第一代遗传图谱相比，第二代连锁图谱极大地提高了图谱的标记密度，同时也扩大了基因组的覆盖距离 , 这种高密度遗传连锁图谱的建成为基因定位、物理图谱的构建及基因的位置克隆 (Positional cloning) 提供了足够密度的遗传图谱 , 奠定了基础。
近年来，研究工作者主要加强完善 29 条常染色体和 2 条性染色体单条染色体的连锁图谱。到目前为止，牛全基因组的连锁图谱上共有 2564 个标记， Roslin 研究所牛基因组数据库中定位到细胞遗传图中的基因和标记数已达 600 多个。随着研究的进一步深入 , 牛基因图谱得到不断更新 , 新的基因位点不断增加。最新基因图谱可从国际互联网获得 , 如美国肉畜研究中心 ( http://sol.marc.usda.gov ), Roslin 研究所 ( http://www.ri.bbsrc.ac.uk ) 。
• 牛 QTL 研究
QTL 定位已成为目前家畜遗传育种研究领域的热点课题，主要有两条技术途径：侯选基因法 (Candidate gene approach) 和基因组扫描法 (Genome scanning) 。相对而言，侯选基因法更具有目标性。研究人员对牛 QTL 作了大量的研究，主要集中在经济和繁殖性状，在奶牛上犹为突出。
Hoeschele I 等 (1990) 发现 Weaver 基因与奶牛产奶性能存在显著相关，存在与 4 号染色体。 Schroote(2002) 等将与奶牛妊娠有关的 QTL 定位在 13 和 19 号染色体上。 Ashwell MS 等 [9] 研究表明，在荷斯坦奶牛的 3 和 20 号染色体上存在影响乳脂率和乳蛋白率的 QTL ，在 18 号染色体上存在影响怀孕率的 QTL 。在 14 号染色体上存在与乳脂含量相关的 K 232A 基因位点 [10] 。 Ashwell 等 [11] 对与牛乳中体细胞数 (SCC) 有关的微卫星标记进行了多年研究 , 认为 SCS 一个 QTL 的最可能位置位于 23 号染色体上的标记 513 附近 (1996 年 ) ； 14 号染色体上的 BM302 ， 18 号染色体上的 BM2078 ， 23 号染色体上的 513 、 BM1443 、 BM1818 、 BM1905 ， 26 号染色体上的 BM4505 对 SCS 有显著影响 (1997) ； 23 号染色体上的标记 513 和 BM1258 对 SCS 有显著影响 (1998) 。 Nash D L [12] 试验表明 , 美国荷斯坦牛临床乳房炎对体细胞评分公牛传递力的回归系数是正的。其后 , 周国利 (2002) 分析了 7 个微卫星座位 BM1818 、 BM1258 、 BM1443 、 BM1905 、 BM302 、 BM4505 和 CYP21 在 240 头奶牛群体中的遗传变异 , 结果表明：这七个微卫星座位均与体细胞数显著相关。乳腺炎抗病力的候选基因为 BOLA 基因。目前对奶牛基因的研究，主要集中在奶牛群中经济性状的不同表型的生化特征的研究 [13] ，如使用候选基因法和数量性状位点定位方法来定位影响奶牛乳腺炎抗病力的基因 [14] 。
• 分子标记辅助
Soller 和 Backman(1983) 以某种遗传标记与 QTL 存在连锁关系为理论依据 , 提出了 “ 标记辅助选择 (MAS)” 。 MAS 由于充分利用了遗传标记、表型和系谱的信息，因此具有比常规遗传评定方法更大的信息量 , 可提高个体遗传评定的准确性。同时在牛育种中应用 MAS 有许多优点：不易受环境的影响 , 且选择没有性别、年龄的限制 , 允许进行早期选种 , 缩短世代间隔 , 提高选择强度 , 从而提高选种的效率和准确性。 Kashi 等 (1990) 对奶牛后备公牛 MAS 研究表明 , 可比传统的后裔测定方法提高 20%-30% 的遗传进展。绝大多数关于 MAS 的研究都只考虑了单个性状，而实际育种往往需要同时对几个性状进行选择 , 最近已有人开展多个性状的 MAS 研究 [15] 。值得一提的是分子遗传标记与体细胞数的变化有关系 [16] ，基因诊断也属于 MAS 的一部分。
若将供体群中少数优良目的基因 (QTL) 导入到受体群， MAS 既可用于跟踪鉴别目的基因 , 又可加速受体基因组 ( 背景基因 ) 的恢复 , 这种方法称为标记辅助导入 (MAI) 。目前 , 有关 MAS 的研究大多采用计算机模拟的方法来进行 , 且在所有模拟研究中，故要求牛 QTL 的位置和效应都必需准确确定。随着牛 QTL 定位的深入发展，标记的数量愈来愈多，标记的信息也将愈来愈准确， MAS 才能真正成为牛品种改良的决定性武器。
• 转基因育种
动物转基因技术是将外源基因整合到动物受体体细胞染色体上，并在受体体内稳定表达出相应的生物学表型而采用的一类综合技术，包括重组子构建技术、重组子导入转化技术、转基因稳定整合及可控性表达技术等。转基因育种打破了不同生物物种间的界限，可将外源基因直接导入动物品种中，能够大幅度缩短世代间隔，培育出新品种。转基因育种可以充分利用所有可能的遗传变异，从而极大地提高牛遗传改良的幅度和速度，同时还可根据人们的需求创造出一些非常规的产品。
• 转基因技术改良牛重要生产性状
目前，转基因牛主要限于转基因奶牛，主要目的是提高产奶量，改变奶成分和品质。由于奶牛的产奶量受激素调节，所以生产高产转基因奶牛需导入提高激素水平的基因。在改变乳成分和奶品质分方面，用牛奶生产奶酪的产率正比于牛奶中 к- 酪蛋白的含量， к- 酪蛋白转基因的高效表达可显著提高牛奶中 к- 酪蛋白组分的比率。乳糖酶转基因在牛乳腺细胞中的表达能导致产生无乳糖牛奶；人转铁蛋白基因在牛乳腺表达，提高乳铁蛋白在牛奶中的含量将会使牛奶使变得更加适宜婴儿食用，是母乳的良好替代品。这几种转基因奶牛已问世。同理，人奶中没有乳球蛋白，而牛奶中含有很高的乳球蛋白，是一种致过敏原，若用人奶中含量高、氨基酸组成非常平衡的乳白蛋白去取代牛奶中乳球蛋白，牛奶会变的更接近人奶。这涉及基因剔除技术，应用在牛上还有很大困难。
• 非常规转基因育种
非常规性转基因育种是指通过将人类药用蛋白基因或工业用酶基因导入畜禽基因组，使目的基因在血液循环系统或乳腺中表达，从而生产出非常规性畜禽产品。畜禽成为了高效生产药用蛋白或工业用酶的化工厂，因此称为动物生物反应器 (Animal bioreactor) 。在奶牛上的研究更多的是集中在利用奶牛乳腺来特异表达外源基因，生产人类药用蛋白和营养保健品，这就是所谓的乳腺生物反应器 (Mammary bioreactor) 。采用乳腺生物反应器生产药用蛋白和营养保健品是一种全新的生产模式。
1990 年，美国获得世界上第一头名为 Herman 的转基因公牛，该公牛可与非转基因母牛生产转基因后代， 1/4 后代母牛乳汁中表达了人乳铁蛋白 , 现己进入临床试验阶段。随后，相继诞生许多其他转基因牛生产的人类药用和保健产品，如： Ⅰ 型人骨胶原、促红细胞生成素 (DEH) 、人溶菌酶、人胆盐刺激脂酶、人催乳素、人乳清白蛋白、人免疫球蛋白、人乳清过氧化酶、人分泌性抗体等。 Chan A W S 等 [17] 通过反转录病毒感染技术获得了转基因奶牛。我国近年来在转基因牛研究上也取得了喜人的成绩：上海医学遗传研究所 2000 年 2 月成功培育出了我国第一头转基因试管牛 ( 取名为 “ 滔滔 ”) 。科研人员导入的白蛋白基因 , 头公牛成熟后，可突破母牛孕期较长的限制，通过配种而加快繁育转基因小牛的速度。 2005 年 1 月中国农大成功培育出了全国首例 “ 人乳化 ” 转基因牛。生产其他一些人类药用蛋白 ( 如胰岛素、干扰素等 ) 的转基因牛也将问世。
乳腺生物反应器存在着许多待解决的问题：由于 乳腺对外源基因的表达具有乳腺特异性，存在转基因动物的异位表达和表达产物的泄漏问题，并且目的基因在受体动物基因组随机整合，不能控制外源 DNA 整合的位点和拷贝数，存在位置效应，降低表达水平，往往造成基因沉默 [18] 。
• 抗病育种
将特定病毒基因组中的某些编码片段作为目的基因导入畜禽基因组，如果该基因能够在宿主基因组中表达，那么转基因动物对该病毒的感染应具有一定的抵抗能力。目前的基因工程技术可以将两个或多个抗病毒基因克隆至同一载体中，将这样的多重抗病毒基因导入动物体，能使不同病毒功能基因协同作用。 2004 年 5 月 日本和美国联合研究培育出抗疯牛病牛，抗葡萄球菌感染乳房炎也问世。相信随着胚胎学、分子生物学和基因工程等技术的不断进步，抗病育种研究不断深入，抗病转基因奶牛新品种的将相待出现。
• 牛分子育种的发展趋势
育种工作是牛业中一项主要的基本建设工作，对促进牛业的发展具有很重要的意义。奶牛自身的生物学特性 ( 如：单胎性、世代间隔长、产乳只限于雌性一方等 ) ，使传统育种工作存在着可供选择范围小、品种育成时间长、公牛选择困难等。传统育种本身存在育成后再想引入新的遗传性状困难大，带有新性状的品种可能同时也携带有害基因，杂交后有可能会降低原有性状等许多弊端。而分子育种能够克服传统杂交选择法的各种缺陷，具有高效、快速育种的特点。
• 新型分子标记的开发与应用是重要研究方向
目前，已有几十种分子遗传标记被用于遗传结构、基因连锁和个体鉴定等研究。根据其形式和发展历程，可将这些分子分为三大类：第一类是以分子杂交为基础的第一代分子标记，以 RFLP 为代表；第二类是以 PCR 为基础的第二代分子标记，以 SSR 为代表 , 包括 RAPD 、 SSCP 、 AFLP 、 PCP-RFLP 等；第三类是以基因序列为基础的第三代分子标记，以 SNP 为代表。新型分子标记具有数目多、稳定性高、适合于高通量决策、对基因直接选择和易于进行自动化、规模化分析等优点。 因此，利用分子辅助标记对目的基因进行分子标记，从而实现对重要经济性状的 MAS 是进行牛分子育种的关键；开发和应用新型分子标记已成为发展分子育种技术的重要方向和研究的热点之一。
• 转基因育种技术是主要途径
转基因动物技术在 20 世纪 80 年代初诞生时起，它就在改良畜禽生产性状、提高畜禽抗病力以及利用转基因畜禽生产非常规畜牧产品 ( 如人药用蛋白和工业用酶 ) 等方面显示了广阔的应用前景。在奶牛上准确的基因转移会大大提高产奶量，改变乳成分，提高乳品质，此外还可以为人类提高更多的各种药用蛋白和营养保健品，使奶牛的经济价值得到更大的发挥。专家们对奶牛的分子改良潜力作了预测，可使奶牛的年产奶量从 8000kg 提高到 12000kg 。近年来，随着基因剔除 (Gene knock out) 、基因打靶 (Gene targeting) 、酵母人工染色体技术等转基因技术的不断进步，转基因的定点整合、整合率和稳定遗传等问题将会逐步得到解决，在奶牛育种中发挥越来越大的作用，必将成为未来培育优质、高产奶量、高抗病性新品种奶牛的主要途径。
• 地方品种优异资源发掘和规模化平台的建设
21 世纪全球畜牧业的 90% 畜禽品种将通过分子育种提供，而品种对整个畜牧业生产的贡献率将达 50% 以上，在牛业上特别是奶牛上更明显。我国牛的品种资源丰富，而且有许多优良基因，但并没有被充分发挥和利用。在基因水平上开展遗传资源开发利用无疑是快速、科学的方法。目前，我国牛分子育种研究较之国际先进国家存在过于分散、简单重复，小规模等问题。大规模现代化设施，新技术和方法等发挥着越来越重要的作用。因此，我国急需建设一个一体化的国家牛分子育种中心，为大规模开展分子育种提供平台。
目前，牛分子育种仍处在发展时期，与传统的常规育种结合显然是加快育种进展，提高准确性的有效途径。毫无疑问，分子育种是现代育种的重要标志，必将成为牛品种改良的主要工具。
