应用饱和糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法调查郑州、商丘和洛阳3个地区的5个奶牛场、2个专业村的582份粪样，查出阳性样品64份，隐孢子虫总阳性率11％（64/582），发现两种不同形态的卵囊，根据其形态结构等特点鉴定为小球隐孢子虫（C.parvum）和安氏隐孢子虫（C.andersoni）。其中2个场奶牛感染安氏隐孢子虫，有1个场的奶牛感染小球隐孢子虫，且感染强度较小。犊牛感染率较育成牛、成年牛高。并进行小球隐孢子虫分离株对初生犊牛的致病性试验，其结果为潜隐期7天，排卵囊高峰出现在感染后第16天，高峰期5天。剖检后消化道黏膜经抗酸染色鉴定，仅在回肠中段发现卵囊。
关键词： 奶牛； 隐孢子虫； 流行病学；试验感染
隐孢子虫(Ｃrytospridium)是世界上公认的引起人畜腹泻的重要寄生性原虫,某些种类可引起哺乳动物的严重腹泻。目前隐孢子虫病已成为世界上最常见的6种腹泻之一，而且艾滋病病人主要继发感染病原之一。犊牛隐孢子虫病首次报道于美国，其后在英国、澳大利亚、加拿大、匈牙利、丹麦、比利时、法国、德国、罗马尼亚、捷克、苏联和日本等国发现。该病主要通过饲料、饮水等经口传染给动物,通过牛奶、饮水、蔬菜等食物经口传染给人,常引起流行和暴发。特别近几年来，作为水源性疾病，越来越受到各国的重视。奶牛隐孢子虫感染在我国也有很多地区发生。宁长申等1997年对河南省部分地区奶牛隐孢子虫病流行病学进行了报道，张龙现等应用PCR-RFLP技术对河南奶牛分离株进行了种类鉴定。为了研究河南省奶牛隐孢子虫病流行规律，在时隔7年之后作者再次对河南省奶牛隐孢子虫病流行病学进行调查，报告如下。
1 材料与方法
1.1 饱和糖溶液漂浮法检查
1.1.1 粪样采集 按3％～5％的比例随机采集郑州、商丘和洛阳3个地区的5个奶牛场，2个专业村奶牛群新鲜粪样，每头份20～200g左右，分装于干净的塑料袋，并标记牛只的年龄及自然状况，带回实验室于4℃冰箱内保存备检。
1.1.2 卵囊检查 每个粪样取10ｇ,加适量自来水,搅匀,铜筛过滤。滤液置离心管中以3 000ｒ/min离心10 min,弃去上清液,再向离心管内加入饱和糖漂浮液10 ml(食用白糖500 ｇ,蒸馏水350 ｍl,石炭酸7.0 ｍl,密度为1.28)。搅匀后以3 000ｒ/min离心10 min,然后用铁丝环沾取表层漂浮液作压片在10×40倍镜下观察、测量。
1.1.3 改良抗酸染色法 染液的配制：甲液为碱性品红4.0 g，95%酒精20 ml，石炭酸8 ml，蒸馏水100 ml；乙液为浓盐酸3 ml，95%酒精100 ml；丙液为2%孔雀绿2.0 g，蒸馏水100 ml。染色时将原液按1∶10用蒸馏水稀释。染色步骤：粪便加水涂片→自然风干→加甲醇固定（晾干5 min左右）→加甲液（5～10 min）→水洗、乙液脱色（至涂样呈淡粉红色）→丙液复染1～2 min→水洗晾干→镜检.
1.2 试验用卵囊准备 调查中收集保存的小球隐孢子虫卵囊，用2.5％重铬酸钾溶液保存于4℃冰箱中。临用前用蒸馏水洗去重铬酸钾，加27％糖溶液7 ml于10 ml的离心管中，然后在糖溶液液面加3 ml粗提卵囊悬液，3 000 r/min离心15 min,用吸管或针头吸取两溶液交界处的卵囊富集层，加蒸馏水至10 ml，3 000 r/min离心15 min，如此反复2次。用血细胞计数板计数，然后加入1 000 IU/ml的双抗，加PBS保存于4℃冰箱中备用。实验犊牛感染剂量为8.51×106个卵囊。
1.3 实验动物及其感染 河南农业大学实验奶牛场馈赠1日龄公牛犊3头，饲养于火焰喷灯消毒的环境中。连续4天检查无隐孢子虫卵囊后,经口感染小球隐孢子虫卵囊。感染后每天用饱和糖溶液漂浮法粪检，若隐孢子虫卵囊为阳性，称取5 g粪便用30 ml自来水稀释、离心沉淀、15 ml饱和糖溶液离心漂浮后涂片镜检，查15个视野，计算平均每个视野的卵囊数。观察犊牛排卵囊规律，包括潜隐期、高峰期、持续期和感染强度。同时观察粪便性状、食欲、精神状况等。
2 结果
2.1 卵囊形态及大小 用改良抗酸法染色的卵囊呈卵圆形或近圆形，呈玫瑰红色，少数内有橘瓣样子孢子，大多数卵囊呈内部结构不清的环状结构，背景为蓝绿色，对比分明。蔗糖浓集法中，卵囊内部呈淡玫瑰红色，囊壁周围有淡绿的光圈。经初步提纯的卵囊见图2。本次调查从奶牛粪样中分离到的隐孢子虫卵囊有大小两种，均为卵圆形，卵囊壁薄、光滑、无微孔和极粒。卵囊内有4个子孢子和1个残体。其中一种测量５０个卵囊，大小为：6.21 μm～9.1 μm×5.12 μm～7.25 μm，平均大小为7.25 μm×6.33 μm，卵囊形状指数(长／宽)为1.05～1.52，平均为1.22。另一种测50个卵囊平均大小为：2.82 μm～4.36 μm×2.82 μm～3.85 μm，平均3.32 μm×3.16 μm,形状指数1.05。与已定名13种中感染哺乳动物的7个种比较，本次调查到的两种隐孢子虫可分别定为安氏隐孢子虫(C.andersonis)和小球隐孢子虫(C.parvum)。
2.2 感染情况 本次调查共检查郑州、商丘和洛阳3个地区的5个奶牛场和饲养奶牛比较集中的两个专业村，共采集样品582份，隐孢子虫总阳性率11％（64/582）。其中小球隐孢子虫感染阳性的奶牛场1个，安氏隐孢子虫感染阳性的奶牛场2个。感染安氏隐子虫的比率为40%(2/5)，感染小球隐孢子虫的比率为20%(1/5)。感染安氏隐孢子虫样品总阳性率为7.9%(44/582)；感染小球隐孢子虫的样品总阳性率为3.1％（20/582）。具体感染情况见表1。
表1 奶牛隐孢子虫感染情况调查结果
采样时间 地点及场名 奶牛年龄 阳性数/采样数 感染种类 阳性率(%)
7月 郑州东郊散养户 ＜6月龄 0/20 - 0
郑 州ND 青年牛 0/16 - 0
郑州西郊散养户 各种年龄 0/39 - 0
郑州YW 青年牛 0/88 - 0
8月 犊 牛 （1～6月龄） 2/24 C.andersoni 8
郑 州RD 青年牛 27/69 C.andersoni 39
产奶牛 0/44 - 0
洛阳SS 各种年龄 0/44 - 0
商丘KD 青年牛 8/78 C.andersoni 10.3
＜6月龄 7/78 C.andersoni 8.97
11月 郑州ND 犊牛 20/26 C.parvum 58.3
青年牛 0/56 - 0
合计 64/582 11.0
2.3 感染强度感染安氏隐孢子虫的牛感染强度均较大,样品采用饱和糖溶液浓集后镜检，在40倍物镜下一个视野可见隐孢子虫卵囊数个别可达400个，多数在20～50个之间。而感染小球隐孢子虫的牛感染强度均较小，每个视野极少有超过5个卵囊的。
2.4 阳性牛的临床表现所有隐孢子虫感染奶牛场中阳性牛均无明显临床表现。
2.5 实验感染犊牛的排卵囊规律人工接种小球隐孢子虫卵囊的犊牛，其潜隐期为7天，排卵囊高峰出现在第16天。高峰期持续 5天，排卵囊持续期为10天，见图1。在400×下平均每视野10个卵囊。犊牛表现明显拉稀症状。
2.6 试验感染牛剖杀后肠道黏膜涂片改良抗酸染色法染色观察犊牛剖杀后消化道黏膜分段涂片染色观察，只在回肠中段发现卵囊。
3 讨论
最近Xiao等报道在现有的已定名的13种隐孢子虫种中， 感染哺乳动物的隐孢子虫有C.andersoni， C.parvum， C.muris，C.felis， C.hominis，C.canis， C.wrairi， 而感染牛的为前3种。C.andersoni大小在7.4 μm～5.55 μm（6.0 μm～8.1 μm到5.0 μm～5.5 μm）， 卵囊指数为1.35。 RA Carreno等把C.andersoni列为个体最大的隐孢子虫。本次查到的卵囊平均在7.25 μm×6.33 μm， 卵囊指数平均为1.22。 大小与宁长申等1997年查到的卵囊平均大小为7.43 μm×5.8 μm接近，但形态更圆些。 根据卵囊形态和大小初步鉴定本次调查中查到的个体较大的虫种为安氏隐孢子虫； 小球隐孢子虫直径大小不超过4.5 μm，平均卵囊指数在1.04～1.22之间。本次调查的小型隐孢子虫大小为3.32 μm×3.16 μm, 形状指数1.05，与薛登民等等分离的牛隐孢子虫大小相近（卵囊大小为2.5 μm～6.0 μm或3.5 μm～4.5 μm）。 与周金林等、 李培英等报道的卵囊大小有差异（小球隐孢子虫平均分别为4.15 μm×4.05 μm和4.78 μm～4.42 μm）。 综合分析，本次分离到的小型虫种初步鉴定为小球隐孢子虫。 本次分离的两个虫种与宁长申等1997年查到虫种不同， 张龙现等对我国不同地区4个分离株的PCR扩增片段SspⅠ酶切结果表明，此前分离的河南安氏隐孢子虫株及长春、 安徽、 北京株的安氏隐孢子虫为同一个种。 本次分离的两个虫种在分子生物学方面的研究正在进行。
由本次调查结果显示不同年龄段奶牛隐孢子虫感染率各不相同，其中犊牛检出率较高，青年牛次之，说明不同年龄奶牛对隐孢子虫的易感性有差别。这个结果与文献报道结果相符。隐孢子虫的流行病学资料统计，全球范围内大约有170种哺乳动物被记录有该虫感染，传播途径是卵囊由粪便到口，表现为动物间，动物与人之间的直接传播和通过污染的食物和饮水的间接传播。郑州ND场为新近搬迁场，在原场址时未查到阳性牛，搬迁到新场址4个月后犊牛感染小球隐孢子虫，而青年牛和成年牛未查到阳性牛只。这种结果提示：造成它感染的原因可能来自于周围环境的携带隐孢子虫动物的或污染的水源传播。由于隐孢子虫的宿主谱较广，野生动物种群隐孢子虫感染情况值得进一步调查和分析。
本次查到的安氏隐孢子虫阳性牛均无明显的临床症状，课题组曾连续检查阳性牛的粪便，虽个别牛的感染强度很大，但未见精神状态及粪便异常。感染小球隐孢子虫的犊牛仅见个别犊牛粪便较稀，但有的阴性犊牛的粪便更稀。这与普遍报道的有拉稀症状有差异，这可能由于感染强度较低。本次动物感染实验的排卵囊潜隐期、高峰期等与Fayer等报道的相似，且小牛出现拉稀症状，但排卵囊量较低。这可能与本次实验感染犊牛年龄偏大有很大关系。Fayer等（1998）报道感染小球隐孢子虫犊牛的年龄均为1～2日龄，即出生后很快即接种隐孢子虫卵囊。但Harp（1990）等对1周龄的犊牛攻击小球隐孢子虫，犊牛排出卵囊并有拉稀症状。本试验所接种犊牛已达到5日龄，而且吃过初乳，这可能会影响其易感性；或者与感染强度较小有关；或者本次调查所见虫种是不同的基因型。攻毒实验的结果证实本次分离的小球隐孢子虫有一定的致病作用。其详细生物学特性尚待进一步研究。
调查中使用的两种检查方法可以互补， 改良抗酸染色法，操作简便、稳定、可靠，视野对比分明，不需要特殊的设备和仪器，试剂易于配制，染色后的玻片便于保存。但由于采样量小，往往容易漏检，而且在染色时，每一步操作都要因温度、涂样量厚薄决定染色、脱色、复染时间长短，否则，易造成着色过重或过轻，不易观察；饱和糖溶液漂浮法检查经济、特异、结果可靠，但样品处理后需要马上观察，否则，卵囊易于变形，不利测量。因此，在本次调查中，我们同时用两种检查方法，有很强的互补性，提高了检出率。
