摘 要：仔猪轮状病毒性腹泻是由猪轮状病毒引起的急性肠道传染病，是危害养猪业的主要疾病之一。猪轮状病毒是一种条件性病原，一般情况下呈隐性感染，当环境因素发生变化、免疫力下降时可暴发。目前尚无有效治疗药物，预防该病的有效方法是加强饲养管理和有效疫苗接种。研制新一代高效、廉价疫苗是重要的研究方向。掌握仔猪轮状病毒性腹泻的动态变化和影响因素，可为其诊断以及疫苗的研制提供科学依据，并为该病发展趋势的科学预测提供数据和信息支持。文章综述了引起仔猪腹泻的猪轮状病毒的分群和分型、培养特性、流行病学、预防治疗及疫苗研制的现状。
关键词：猪轮状病毒；仔猪腹泻；流行病学；病原；疫苗接种
仔猪轮状病毒性腹泻主要以腹泻、厌食、呕吐、脱水为特征，一旦暴发就可能连年发生，患病猪和隐性带毒猪是该病的主要传染源。Woode等在1974年首次从猪分离出轮状病毒。中国于1982年从腹泻猪粪便中分离到轮状病毒。澳大利亚、美国、英国等先后都有关于该病毒的报道，目前该病在全世界普遍存在。我国轮状病毒流行的特点是混合感染，由于饲养环境较差，人们往往认为这一时期仔猪腹泻是大肠埃希菌引发，其实轮状病毒是其发病的一个重要诱因。轮状病毒性腹泻对人类健康和畜牧业发展都有较大危害，在全球已成为一个重要的公共卫生问题。
1 病原学
1.1 病毒形态及分子特征
轮状病毒(Rotavirus， RV)属呼肠病毒科，轮状病毒属，分为A，B，C，D和E和F 6个群，在发生腹泻的动物中最常见的是A群，感染猪的RV有A群、B群、C群和E群。其中，A群称为典型RV，其他则称为非典型RV[1-3]。纯化的病毒在电镜下略呈球状，具有双层衣壳，直径为65 nm～75 nm，20面体对称。病毒的中央为一个电子致密的六角形核心，直径37 nm～40 nm，即芯髓；周围有一电子透明层，壳粒由此向外呈辐射状排列，构成内衣壳；外周为一层光滑薄膜构成的外衣壳，厚约20 nm。RV因其形似车轮状结构而得名。病毒颗粒在感染的粪样和细胞培养物中以两种形式存在，一种是含有完整外壳的实心光滑型颗粒，大约70 nm～75 nm，具有传染性；另一种是不含外壳且仅含有内壳的粗糙型颗粒，大约50 nm～60 nm[1-2]。
病毒体核心是由11个不连续的双股正链RNA片段组成，除了片段11具有2个开放阅读框外，其他的片段只有1个开放阅读框。每一片段各编码一种蛋白，包括6种结构蛋白即VP1～VP4，VP6和VP7。VP1～VP3为芯髓蛋白，VP4和VP7为外衣壳蛋白，VP6为内衣壳蛋白[3-5]。在病毒侵入细胞的过程当中VP4起到关键作用，VP4经胰蛋白酶(Trypsin)裂解可产生VP5(60 ku)和VP8(26 ku)2个结构部分，与病毒附着、聚集有重要关系，并能提高病毒感染性。研究表明，VP7具有稳定VP4结构的作用[6]。此外，还有5种非结构蛋白即NSP1～NSP5，其中NSP1，NSP2，NSP3，NSP5为RNA结合蛋白，与病毒的复制、合成和表达有关[7]。NSP4是一种糖蛋白，与病毒粒子从内质网出芽有关，在病毒的复制以及致病机理方面具有重要作用。NSP4的突变可以影响病毒的毒力[8]。
1.2 病毒分型
利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术可将RV的11个双链RNA片段分离，所形成的11条电泳带可以分为4个区段，常见的人和动物的电泳带的排列位置为4∶2∶3∶2，统称为A群，又叫典型RV。此外，以第10和11节段在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率上的差异，A群RV又分长型和短型。其他统称为非典型RV，分别为B， C， D， E， F和G群。RV属于呼肠病毒科RV属的A，B，C和E群。
RV粒子表面共有3种抗原，即群抗原VP6、中和抗原VP7及血凝素抗原VP4[2，6]。根据群抗原VP6可以分为不同的亚群，大多数动物的A群RV为Ⅰ亚群；VP4和VP7在病原的检测和产生中和抗体以及免疫性保护过程中具有重要意义，可根据VP4和VP7分为不同的血清型系统[7-9]。根据VP4形成的血清型为P(Protease sensitive)型，VP7形成的血清型叫G (Glycoprotein)型。RV不同血清型之间的交叉反应性较差，根据RV的分子流行病学调查发现，目前已知至少有18种P血清亚型和14个G血清亚型存在[10]。在世界广泛流行的A组RV主要有4种G和P血清型组合——G1 P8， G2 P4， G3 P8和G4 P8[11]。
1.3 培养特性
RV于1968年由美国的Mebus M S等首次从犊牛粪便中分离成功， 1980年，美国的Waytt将人的Wa株首次利用非洲绿猴肾原代细胞培养成功。RV在体外不易培养，需要特殊培养条件，除A型RV外，其他RV的许多毒株迄今未能适应细胞培养，A型RV分离的成功率为40%～70%。因此，只能通过感染易感动物来分离和复制病毒[12]，培养过程需加胰蛋白酶和胰凝乳酶等处理。黄旭雯等利用CV-1细胞增殖培养RV时发现，同时添加40 mL/L的鸡血清和10 μg/mL胰蛋白酶有利于RV的复制。此外，RV感染细胞具有特定的趋向性，在体内只感染肠绒毛上皮细胞，在体外尽管可以吸附许多细胞，但是只感染肾或肠道上皮细胞来源的细胞。培养RV常用的细胞系为MA-104、AGMK、CV-1、MARC-145等 [13]，但最适合用MA-104培养。
1.4 稳定性
RV对理化因素的作用有较强的抵抗力，粪便和乳汁中的病毒在18 ℃～20 ℃室温中经7个月仍有感染性，而蛋白水解酶如胰凝乳蛋白酶，能增强RV的感染性。耐乙醚、氯仿、去氧胆酸钠、次氯酸盐和脂溶剂，对酸稳定，pH 3.5～10.0范围内病毒保持感染力。经反复冻融，超声波处理，以及37 ℃下1 h仍不失活。但EDTA，EGTA等促溶剂及CaCl2、硫氯酸钾等可使双衣壳病毒粒子变为单衣壳病毒粒子，使芯髓部分的密度发生改变，病毒聚合酶的活性丧失而失去感染力。另外0.1 g/L碘、10 g/L次氯酸钠、700 mL/L酒精、臭氧、酚等可灭活病毒。
2 仔猪轮状病毒性腹泻的流行现状
轮状病毒感染(Rotavirus infection)主要是多种幼龄动物(包括仔猪、犊、羔、驹、犬及家禽在内)的一种急性肠道传染病[13-15]。各种动物的RV都对各自的幼龄动物呈现明显的致病性，一旦发病后可能每年连续发生，病畜和隐性带毒者是本病的传染源。El Attar L等[16]试验结果表明，在适宜的条件下，感染某种动物的轮状病毒会因一种致病的适应轮状病毒给其他动物带来感染隐患，例如在犊牛和猪、人和猪之间。该病主要以厌食、呕吐、腹泻和脱水、体重减轻为特征，对人类健康和畜牧业发展都有较大危害。
1974年Woode等在英国首次报道猪的RV后，RV在猪中的传播引起了许多国家的重视，接着澳大利亚、北爱尔兰、美国、法国等均有RV引起仔猪腹泻的报道。据报道，美国断奶仔猪感染阳性率为80%，病死率为15%；当有混合感染时，病死率更高。波兰学者Markowska-Daniel等对11个大型猪场2周龄～10周龄腹泻仔猪(断乳前发病率为8%～15%)采集1 230份血清和531份粪样进行RV抗体检测及病毒分离，结果经ELISA检测有1 214份血清为RV抗体阳性，169个粪样为抗原阳性。选择其中28份ELISA抗原阳性粪样用MA-104细胞系进行分毒，结果有18份(64.3%)可见到CPE反应，免疫荧光和电镜检查则均为阳性，PAGE电泳测定有22份(79%)为阳性。英国报道1周龄～4周龄仔猪的发病率超过80%，病死率10%～30%，发病猪体重急剧下降10%～20%，需半个月甚至更长时间才能回复到正常生长速度，这是该病的特征，同时也说明该病在经济上的影响更为重要。加拿大Dewey C等研究了感染猪只的A群RV与饲养规模管理时发现，饲养规模大且断奶较早的仔猪群易感染A群RV，阳性比率较高；集约化生产模式较持续流动设施条件下饲养的仔猪，其A群RV阳性感染率其前者比后者高3.4倍[17]。英国学者Kilion研究表明，RV与致病性大肠埃希菌混和感染时，由于二者在致病过程中相互促进，所造成的危害要远远大于二者之和，而且是仔猪断奶后引发腹泻的一个重要原因。Barman N N 等[18]对位于印度Assam地区的528份猪血清样品进行了间接ELISA检测，其中RV阳性率占51.1%，高于TGEV (39.4%)和PEDV (21.2%)，约13.6%的猪只血清样品中含抗以上3种病毒的抗体。
RV是猪病毒性腹泻的主要病原之一，约占10%～15%，在美国猪病毒性腹泻中由RV造成的损失仅次于TGEV，所以国外是非常重视的对RV的防制。中国自1982年从腹泻猪粪便中分离到RV，证实猪RV感染在我国普遍存在，至今已有24年[19-20]。该病可以引起仔猪的死亡，成年猪的掉膘，饲料报酬的降低，增加人工费和药费的开支等。李国平等用RV抗原酶标诊断试剂盒对福建省福州、南平等地的部分猪场进行了仔猪RV感染情况调查，结果显示10日龄至断奶仔猪的阳性率高达82.3%～91.7%。2003年冬季至2004年春季，上海一些规模化猪场的生产母猪虽然已按程序进行了猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联苗免疫，但其产下的仔猪仍发生病毒性腹泻，经诊断为猪RV感染，造成很大损失。程健频等于2002年10月对甘肃省庄浪县7个乡镇90户饲养的2 100头仔猪进行了初步调查，发病仔猪1 460头，发病率达69.5%，其中环境温度下降继发大肠埃希菌病死亡690头，死亡率47.8%[21]；王玉春等1990年对国内19个省共计121个猪场做血清学调查，未发现阴性猪群。
RV主要侵害小肠绒毛细胞，在胞浆内增殖，受损细胞可脱落至肠腔，随粪便排到外界环境，污染饲料、饮水、用具、土壤等，经消化道感染易感家畜。各日龄的仔猪及产前5 d至产后2周的母猪均易感，该病症状轻重决定于发病日龄或环境条件，仔猪出生头几天，感染发病症状重，病死率高达100%；10日龄～21日龄哺乳仔猪症状轻，病死率低；3周龄～8周龄病死率高，可达50%。母猪感染本病时，虽无明显症状，但经粪-口途径传播病毒，感染仔猪，造成仔猪腹泻，一般3 d～7 d死亡。若与传染性胃肠炎和大肠埃希菌混和感染则病情加重，死亡率更高，对养猪业造成的损失更加严重。
目前，我国规模化、集约化养猪已占相当比重，2005年生猪存栏约为6.52亿头，而进行RV免疫接种的猪只不到1 000万头，大部分猪群处于免疫空白状态，造成易感猪群的广泛存在，为轮状病毒腹泻留下了巨大潜在的隐患。规模化、集约化养猪场如果一旦发病，将造成严重的经济损失。目前，我国RV流行和危害的特点是混合感染，RV发病主要在8周龄以内，与大肠埃希菌所引发仔猪的白痢和断奶前后引发的腹泻是同一时期，人们往往认为这一时期仔猪腹泻是由大肠埃希菌引发，其实猪场中的大肠埃希菌绝大多数是条件性致病菌，而RV是其发病的一个重要诱因，所以大量使用抗生素治疗后，虽有一定效果但仍不能完全控制病情，其原因就是忽略了RV的致病力。
3 预防治疗及疫苗研制现状
目前，RV感染无特殊治疗药物，主要采取对症治疗，防止脱水，维持电解质的平衡，而疫苗预防和加强管理是控制RV感染的有效手段。
对病猪舍的粪便、垫草要及时清扫，要定期对地面、用具等用消毒剂消毒。
加强饲养管理，给予营养全价的饲料，增强猪只抵抗力；饲养密度要适中，圈舍要经常保持清洁、通风透光，注意保暖。
仔猪RV腹泻没有特效的中西治疗药物，抗菌药品可减少细菌的继发感染，重点是补液，可以饮服或注射电解质，尽可能减少脱水和酸中毒。
RV疫苗能刺激机体产生局部和血清抗体，可预防RV的感染和减少重症RV腹泻的发生[22]，母源抗体能大幅度减少和减轻仔猪RV的发病。
目前，猪RV疫苗主要有两种类型：一类是细胞灭活苗，是将适应MA-104细胞的低代次毒灭活后以矿物油为佐剂制备而成的，油佐剂灭活苗，在怀孕母猪分娩前30 d免疫，仔猪在出生后7 d和21 d各免疫1次；另一类是美国Ambico公司研制的弱毒苗，由Al(OSU株)和A2(Iowa株)组成，疫苗株的病毒含量为107.5TCID50/mL，接种途径为口服或肌肉注射，弱毒苗在分娩前5周和2周各接种1次。弱毒苗与灭活苗的比较试验结果表明，接种弱毒苗能完全阻止发病和排毒，攻毒保护率达95%，而灭活苗各项指标都比较低。此外，也可以通过异源疫苗来免疫，异源苗免疫的主要机制是利用VP6的保护作用。Bishop R F等在给无菌仔猪免疫人RV-3， 10 d～14 d后用猪RV A/T76攻毒，结果发现试验组只发生轻微的腹泻，而对照组却发生严重的腹泻。
目前，世界各国预防猪RV感染主要以弱毒苗为主，疫苗种类有美国RV弱毒苗、RV-TGEV二联弱毒苗和俄罗斯的三联弱毒苗。国内猪RV疫苗的研究一直是一个薄弱环节。我国猪群RV的阳性率非常高，且混合感染严重，开发研制多联苗是十分必要的，这其中驯化出免疫原性好、效价高的弱毒株是多联苗研制成败的关键。目前，临床应用的有中国农科院哈尔滨兽医研究所研制的TGEV二联弱毒苗。另外，福建省生物药品厂同中国农业大学联合开发的TGE-PED-RV三联弱毒苗也将推广。
当前生物工程技术日新月异的发展，为RV疫苗的研究带来了新方法、新工艺[23]。由于RV为分段基因组，所以可用人兽基因组混合物构建杂种基因组生产疫苗，这种方法既可解决减毒问题，也可解决RV的组织培养问题[24-25]。如亚单位疫苗现在已经在大肠埃希菌等表达系统中成功的表达了RV不同的结构蛋白，为研究不同结构蛋白的作用以及亚单位疫苗的研制提供了可能，在储存、运输等过程当中效价很稳定，没有副作用。另一方面，克隆化的基因工程疫苗和核酸疫苗也是指轮状病毒疫苗的研究方向。
(王 玲1，2，蒲万霞1，2，常惠芸1，华兰英2，索朗斯珠3 1.中国农业科学院兰州兽医研究所农业部畜禽病毒学重点开放实验室，甘肃兰州 730046；2.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，甘肃兰州 730050；3.西藏农牧学院畜牧兽医系，西藏林芝 860000)
