关键词：胸膜肺炎放线杆菌；诊断；猪
猪传染性胸膜肺炎由Pattison等于1957年首次报道。随后在许多国家和地区均有该病发生[1]。在我国，杨旭夫等于1987年通过病原分离鉴定和血清分型、血清学诊断和人工复制病变等首次证明我国存在猪传染性胸膜肺炎[2]，1990年由杨旭夫首次正式确认我国大型集约化养猪场存在猪传染性胸膜肺炎，并分离出致病菌，同时确定了血清型。
1 病原特性
猪传染性胞膜肺炎的病原为胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）。因分离的年代和时间不同，曾由Shope和White等人在1964年命名为胸膜肺炎嗜血杆菌(H.pleuropeumoniae)。而副溶血嗜血杆菌的名称是基于加利佛尼亚菌株和瑞士分离菌株所引起的本病而得名。APP是革兰氏阴性、有荚膜的多形性球状短杆菌，老龄培养物偶可见到丝状，在血液琼脂平板上呈不透明扁平的圆菌落，其大小为1 mm~1.5 mm，周围呈β溶血，用铂耳触之有黏性感，在β毒素源性金黄色葡萄球菌周围产生更宽的溶血带和“卫星”现象，兼性厌氧，不运动，不产生芽孢，尿素酶阳性。生物Ⅰ型生长依赖NAD，生物Ⅱ型不依赖NAD，能在麦康凯琼脂平板上生长[3]。
到目前为止，报道的血清型共有15个，其血清型的划分是依据荚膜多糖和菌体脂多糖的抗原性不同来区分的[4]。根据是否依赖NAD可分为生物Ⅰ型和生物Ⅱ型两个生物型。其中APP-1～12型是典型的生物Ⅰ型，APP-15型发现较晚，其生物活性需要NAD。其中血清Ⅰ型被分成2个亚型即1A和1B，血清5型被分成2个亚型即5A和5B。APP-13型和APP-14型为生物Ⅱ型（Nielsen等，1997）。其中生物Ⅰ型对猪具有致病性。生物Ⅰ型中的1、5、9、10、11等5种血清型致病力最强。生物Ⅱ型(13和14)分布于欧洲及美国，其致病性比生物Ⅰ型要弱。某些血清型抗原之间有相似性，所以在血清型1、9、11，3、6、8，4、7之间有交叉反应。多数国家为复合型感染。据统计，我国流行的血清型为1、2、3、5、7、10等型，以1、3、7型为主。主要血清型间缺乏交叉免疫性[5]。
APP共产生4种毒素，都属于RTX（repeat in structure toxin）毒素家族。1999年以前人们只认识了3种毒素，并对其进行了深入的研究。3种Apx毒素不仅是APP致病的主要毒力因子[6]，也是主要的保护性抗原[7]。每个血清型产生的毒素不相同（表1）。
表1 Apx毒素在不同APP血清型中的分布
Table 1 Distribution of Apx toxins in different APP serotypes
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Toxin Types 毒素类型 |
APP血清型 APP Serotypes | ||||||||||||||
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Apx I |
1 |
5 |
9 |
10 |
11 |
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Apx II |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
11 |
12 |
13 |
14 |
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Apx III |
2 |
3 |
4 |
6 |
8 |
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Apx IVA |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
13 |
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2 诊断
2．1 病原分离鉴定
此病易从患本病猪的支气管、鼻腔分泌物、扁桃体或肺部病变组织中分离到病原菌。但从陈旧病变组织中分离较为困难。蔡宝祥（1996）用加有V因子的巧克力平皿和牛羊血琼脂平皿，逯忠新（1999）用马血胰蛋白胨大豆汤巧克力琼脂平皿分离出本菌，也有介绍用100 mL/L绵羊血液琼脂平板与滋养菌株表皮葡萄球菌交叉划线，体积分数为5%～10% CO2培养箱37 ℃过夜培养，也可以分离出本菌。笔者用含0.1 mL/L NAD的兔血巧克力琼脂平皿，含0.1 mL/L NAD的胰胨大豆胨平皿，在普通营养琼脂涂布0.1 mL/L NAD用来分离和增殖培养APP，均长出菌落。鉴定可根据放线杆菌的特性，再用APP-1~15血清型高免血清做玻片凝集试验，如为阳性，再用琼脂扩散试验做最后确定[5]。
2．2 血清学诊断
血清学试验主要用于筛选试验和流行病学的研究。国内外建立了许多血清学方法广泛用于该病的检测。
(1)协同凝集试验。Mittal K R等（1987）用协同凝集试验给已知血清型分型，首先用属于已知血清型的参照菌株检验了待试方法，用协同凝集试验获得的结果与已知血清型菌株的荚膜血清型完全一致。用协同凝集试验检测了属于已知血清型的一组100个另外的菌株，结果与环状沉淀试验（RP）结果很一致，全菌细胞悬液或其盐水浸液的协同凝集试验结果一致。当用全菌细胞悬液或其盐水浸液时，不同血清型之间无交叉反应。然而当全菌盐水悬液在4 ℃保存较长时间或煮沸15 min时，除血清型6与3、5有轻微的交叉反应外，所有抗原在本试验中表现型特异性。对检测细菌悬液的特异性抗原，协同凝集试验比环状沉淀试验（RP）敏感2倍~32倍，协同凝集试验比RP更方便，检测效果也更好。
（2）琼脂扩散试验。朱士盛等（1999）用分离到的APP HT株制备酚水抗原，超声波处理抗原和CTAB处理抗原，分别与自制的APP-1～12型因子血清做琼脂扩散试验，与8型呈阴性，尤以酚水抗原最佳，沉淀线最清晰。笔者按文献[9]制备APP1、2、3、4、6、7、8、9、10型因子血清和酚水抗原做琼脂扩散试验，结果表明型交叉反应减少了，型特异性比直接凝集试验好，但是时间较长，步骤烦琐，灵敏性不高，需要重复加样。
（3）补体结合试验（CFT）。朱士盛等于1987年用补体结合试验方法，诊断猪胸膜肺炎获得满意结果。CFT的特异性比间接血凝试验（IHA）高，能够将APP和HP区别开。虽然多用于APP的检测和分型，但敏感性不及其他检测方法，而且操作烦琐，只能在实验室进行。
（4）间接血凝试验（IHA）。逮忠新等[10]报道，经戊二醛-鞣酸化处理的绵羊红细胞用猪胸膜肺炎放线杆菌抗原致敏，以IHA来检测APP病猪血清抗体。本检测方法适用于APP流行病学的调查和定性。IHA具有敏感、特异和可早期诊断的特点，适于推广运用。
（5）乳胶凝集试验（LAT） 。有报道用这一方法对1，2，3，5和9进行分型，但是在应用过程中也出现了不同血清型之间的交叉反应的情况。Inzana T J[11]提出了一种改进的乳胶凝集试验检测方法。该方法使用荚膜特异的IgG抗体检测APP菌体或组织样品，其特异性好，不与异型血清反应，也不与多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌和放线杆菌反应。
（6）酶联免疫吸附试验（ELISA）。①型特异性ELISA 是指只能对某一种血清型的APP作出检测的ELISA方法[4]。徐瑞等（1989）人介绍了检测猪血清中APP抗体的ELISA方法。Loftager Nielsen等（1993）用ELISA检测APP血清型2抗体。Nielsen R等(1993)用阻断ELISA检测APP血清型8抗体。Klausen J等[12]用阻断ELISA检测APP血清型6抗体。Radovici S(1994)将提取的血清型1菌株的脂多糖作抗原建立检测APP的ELISA方法。Bosse J T等 (1993)用包含有血清型1、5、7型特异性脂多糖的混合抗原建立ELISA试验。②种特异性ELISA 是指能对所有血清型的APP做出检测的ELISA方法[4]。Jiannen M等[13]建立了种特异性的间接ELISA方法。以5型APP的培养物上清液（主要成分是ApxⅠ和ApxⅡ）浓缩后免疫家兔，制备的抗血清经亲和纯化后包被ELISA酶标板。该方法的稳定性和重复性好，但对不同血清型检测结果的强弱不同。Leiner G(1999)以原核表达的ApxⅡ的重组蛋白作为抗原，建立了种特异的ELISA诊断方法，因ApxⅡ在除10型外所有的血清型中都可以表达，所以该方法理论上可以对几乎所有的APP感染做出检测。Leiner以2，3，5，7和9型的APP感染猪群作为检测对象，共检测了400份血清，其中有243份阳性，其结果与CFT试验的相关性很高，敏感性比CFT高。Leiner G认为该方法对于实验室检测以及养殖场监控APP非常有用。刘建杰等[14]将apxICA克隆表达，将表达的蛋白作为抗原建立了检测apxI血清抗体的ELISA方法，主要用于APP强毒株感染的检测。
（7）HNT试验检测APP。Kansas州立大学的诊断与病理生物学系提供了用HN滴定检测APP血清型1、5、9、10、11的方法，该方法建立在被检血清中和某些血清型产生的Ⅰ型溶血素与细胞毒素（ApxI）的能力的基础上，只能用于诊断APP生物Ⅰ型的血清型1、5、9、10、11感染。Sicnback E I(1994)报道用抑制酶免疫测定法检测猪血清中的APP血清型2的抗体；Gottschalk M(1994)报道APP血清型5的长链脂多糖用于APP血清学诊断。
（8）免疫磁化法分离APP血清型2菌株。Angen O等[15]介绍了基于免疫磁化珠的免疫磁化分离技术（IMS），从纯培养物和异质悬液中分离APP血清型2菌株。用单克隆抗体（MAb）或和多克隆抗体（PAb）来包被磁化珠，从纯培养物和异质悬液中分离APP血清型2菌株。比较该方法从纯培养物、混合培养物和人工感染猪扁桃体中的分离率，没有明显差异。给12头猪人工APP气雾感染，从鼻腔和扁桃体拭子培养物中未发现APP血清型2菌株，6周后PCR试验也不能检出，但是用免疫磁珠法，能从3头猪的扁桃体中检出APP血清型2菌株。因此，免疫磁珠法是从组织中检测分离APP血清型2的一种高敏感度的有效方法。Gagne A等用免疫磁珠法选择性地分离APP血清型1菌株。他从感染猪群中采集扁桃体腺，用免疫磁珠技术和标准方法的检出率为68%和22%[16]。
（9）用APP血清型2脂多糖的O抗原单克隆抗体对野外分离株进行鉴定。Rodriguez Barbosa J I等[17]报道了用APP血清型2脂多糖的O抗原单克隆抗体对野外分离株进行鉴定的方法。该方法与以前建立的多克隆兔抗APP抗体红细胞凝集试验和单抗ELISA试验的符合度为97.4%。单克隆抗体对于APP血清型2的鉴定是一种很有用的检测方法和分型手段。
2．3 分子生物学技术检测APP
（1）PCR技术检测APP。Frey等于1995年用PCR分型系统分析了胸膜肺炎放线杆菌的毒素基因模式。Gram T等（1999）为了检测各血清型的APP的外膜蛋白（OmlA）基因，从基因片段中部区域不同部位构建了4种不同的反录引物,在PCR分型试验中它们与LPF前导引物化合。OmlA基因的易变性被用于建立一种PCR分型系统，OmlA基因中部区域的序列差异把APP的血清型分为5种不同的群体。Gram T等（1999）报道，280个扁桃体腺分离物的PCR毒素基因分型结果表明，268个（96%）菌株具有反映其血清型的apx基因。Gram T,Ahrens P（2000）报道了编码OmlA基因建立PCR检测APP，并据此对血清型分群。Gram T等把他们自己测定的基因序列与Chevalier Kobisch等测定的OmlA基因序列比较，发现除血清型8以外，其余结果都相同。
De la Puente Redendo V A等（2000）报道用PCR-RFLP技术分析tbpA和tbpB基因对APP检测与分型。Hernanz Moral（1999）对APP aroA基因克隆并测序，建立了快速鉴定的PCR方法。Chiers等（2001）用PCR试验扩增dsbE类基因检测鼻腔和扁桃体拭子培养基中的APP。把该试验方法与基于扩增OmlA基因的PCR试验相比较，表明该试验的符合度很好。特异性和敏感性符合度分别为95%和82%。刘军法等[18]建立的PCR方法用血清2、5、6、9、10均能扩增出预期片段。何启盖等[19]用PCR方法对分离菌株进行鉴定。王贵平等[20]根据Apx Ⅳ基因序列设计了一对可以扩增422 bp片段的特异性引物，成功的建立了一种检测APP的快速PCR方法，并确定其特异性和灵敏性。
（2）DNA指纹识别技术用于APP的精确分型。Rychilk I等 [21]报道了用DNA指纹识别技术来对APP精确分型。选取了23个APP菌株，其中12个参照菌株，每个菌株代表一个血清型；11个血清型9株菌。对12个参照血清型进行分型，用该技术可以区分出9个，但重复实验表明，血清型1、9、11之间有很好的相关性，不好区分。在12个血清型9菌株中可以鉴定4个DNA型。表明该方法可以用于APP的诊断与血清分型。
