摘 要：隐性乳房炎是奶牛高发病之一，对奶牛及奶业发展造成了重要影响。该文对奶牛隐性乳房炎的发病原因、发病规律、诊断方法、预防措施等进行了探讨，并介绍了基因疫苗和细胞因子在乳房炎预防中的作用，以及PCR与蛋白组学方法在奶牛乳房炎诊断方面的应用。
关键词：奶牛；隐性乳房炎；诊断；预防
奶牛乳房炎根据临床表现可分为临床型和隐性型两种，其中隐性乳房炎(Subclinic mastitis)乳汁无肉眼可见变化，临床症状不明显，诊断困难，疗效较差，造成奶品质量下降，最终危及人类健康。隐性乳房炎给世界和我国奶牛业造成的经济损失很大，据美国国家乳房炎委员会报道，患隐性乳房炎的奶牛每个乳区每泌乳期少产636 kg～773 kg奶。20世纪90年代，乳房炎给美国造成的经济损失每头牛每年约185美元，每年因乳房炎造成的经济损失达10.8亿美元。据统计，2000年我国奶牛总头数为488.7万头，乳总产量为919.1万吨，年单产为3 087 kg[1]，而我国泌乳牛约为298.6万头，每年因隐性乳房炎造成的经济损失达1.35亿元人民币。
1 发病原因
引起乳房炎的微生物主要是多种非特定的病原微生物，包括细菌、支原体、真菌和病毒等，据报道己达150多种[2]。据叶定生等报道，安徽保健奶牛场奶牛隐性乳房炎病原菌主要是表皮葡萄球菌、金黄色葡菌球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和乳房链球菌，占总检出菌的92%。据许丹宁等[3]对某大型奶牛场调查显示，隐性乳房炎发病率为68.42%，主要病原有葡萄球菌、链球菌和革兰氏阴性杆菌3类，葡萄球菌占37.29%，链球菌占38.98%，革兰氏阴性杆菌占23.73%。易本驰[4]对信阳地区的调查显示隐性乳房炎发病率为51.81%，其中葡萄球菌占35.63%，链球菌占14.94%，革兰氏阴性杆菌占49.43%。据周延宣等[5]报道，从重庆地区患隐性乳房炎分离病原菌以葡萄球菌和链球菌为主，占检出细菌总数的94.6%。不同报道显示隐性乳房炎的主要病原微生物有一定差异，但主要病原菌是金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠埃希菌等。另外，环境因素如牛舍、牛床、牛槽和蓐草脏污，排水不畅，牛体以及乳房周围污垢太多，卫生条件太差，气温过高或过低，挤奶方法不当等[6]。其他物理、化学损伤以及遗传缺陷等也可能诱发隐性乳房炎。
2 发病规律
研究表明，隐性乳房炎的发生与胎次、乳区、年龄、泌乳月份等有一定的关系。据苏俊强等报道，隐性乳房炎的阳性率随胎次的增加而增高，5胎以上为38.88%，显著高于前4个月；随泌乳月的增加而增加，3个月以后显著高于前2个月；左乳区发生率明显高于右乳区，前乳区发生率高于后乳区。段玉等[7]对大理地区的调查显示，3岁～4岁的奶牛隐性乳房炎发病率明显低于5岁～9岁奶牛，且随着年龄增大发病率增高，7月～9月的隐性乳房炎的发病率显著高于10月和11月。郭小雅等[8]的调查则表明，左、右侧乳区隐性乳房炎发生率分别为21.70%和17.00%，左侧乳区极显著高于右侧乳区，高出4.70%。前后乳区隐性乳房炎发生率分别为18.96%和19.74%，差异不显著；5岁以上泌乳奶牛患病率显著高于2岁～4岁奶牛的患病率，3胎以上奶牛患病率显著高于1胎～2胎的奶牛患病率，第5泌乳月、第6泌乳月及第9泌乳月以上的奶牛发病率较高。以上研究结果表明，奶牛隐性乳房炎的发病率随年龄、胎次、泌乳月份的增加而增加，左乳区高于右乳区，前乳区高于后乳区。
3 诊断方法
隐性乳房炎乳房无临床症状，乳汁也无肉眼可见变化，但乳汁的pH、导电率和乳汁中的体细胞数量等都高于正常值，只有通过实验室检验才做作出诊断。目前，隐性乳房炎的诊断方法主要有乳汁病原微生物检查、乳汁细胞学检查、乳汁pH检查、乳汁导电性检查、酶检验法、PCR检测方法、被毛微量元素检测法、乳清电泳诊断法等。
3.1 乳汁病原微生物检查
隐性乳房炎由多种非特定的病原微生物引起，如细菌、真菌、病毒、支原体等。通常主要的病原是链球菌属、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和支原体。链球菌属、金黄色葡萄球菌占病原菌的90%～95%[9]。有些病原菌虽存在于乳房内，但不一定致病。因此，仅仅依据乳汁中有无病原菌进行诊断不可靠，只能根据检出病原菌的种类、数量做出初步的诊断。
3.2 乳汁细胞学检查
乳汁体细胞计数(somatic cell counts，SCC)是常用的乳房炎诊断方法。奶牛发生乳房炎时，乳汁中的体细胞数目增加，特别是白细胞数目显著增加[1011]。因为乳腺感染细菌后，细菌的代谢产物诱导多形核白细胞进入乳腺细胞；同时损伤脱落的上皮细胞也进入乳汁中，致使乳汁中的体细胞数目增加。因此，可通过检测乳汁中体细胞的多少来判断奶牛是否患有隐性乳房炎。乳汁体细胞检查的方法有多种，例如，Little R B等[12]的乳汁体细胞直接显微镜计数法 (DMSCC)、荧光电子细胞计数法、桶奶细胞计数法(BMCC)和牛只细胞计数法(ICCC)等。间接检验体细胞方法有美国加州乳房炎检验(California mastitis test，CMT)法，以及国内类似的方法，如兰州乳房炎检验(LMT)法、杭州乳房炎检验(HMT)法、北京乳房炎检验(BMT)法等。其他化学检查法还包括氢氧化钠凝乳法和过氧化氢酶法、氯化钙凝乳试验 (改良NFT法)及氯化物硝酸银试验等。
3.3 乳汁pH检查
现已证明乳房炎病牛乳汁呈碱性，且碱性随着乳房炎的加剧而升高。乳腺的炎症导致白细胞尤其是中性粒细胞大量渗出，显微镜染色镜检计数观察，奶牛隐性乳房炎阳性乳中中性粒细胞在50%～90%之间。随着炎性反应的加重，血液与牛乳之间的pH梯度差缩小，导致牛乳pH逐渐升高，趋向于血液pH 7.4。因此，可通过检测乳汁pH的方法来检测乳房炎。刘文进等[13]证明乳房炎病牛血液pH与体细胞数量存在一定的相关性，进一步说明了乳汁pH检查法的作用。
3.3.1 溴麝香草酚蓝检验法 溴麝香草酚蓝检验法(bromothymol blue，BTB)是通过检测乳汁中pH来诊断隐性乳房炎。BTB法有两种操作方法，即试管法和玻片法。
3.3.2 试纸法 1976年，Joshis V等报道了用奶牛乳房炎试纸进行隐性乳房炎现场诊断。在国内，王林安等1985年研制出奶牛乳房炎试纸，并已应用于生产。日本还研制出日本乳房炎简易检验法(PL试验)，这种方法需要把乳汁中的乳清分离出来作为病料检查。在我国，张蔓茹等对BPB(bromphenol blue，BPB)法进行改进，探讨了全乳加醋酸和全乳不加醋酸处理的BPB滤纸片快速诊断法。结果表明，全乳BPB诊断法准确可靠，而且灵敏度较高。
3.4 乳汁导电性检查
可以通过检测乳汁的电导率来监测隐性乳房炎，国内已使用的有山西农大SXⅠ型乳房炎诊断仪、CN乳房炎诊断仪等。祁克宗等研究表明，隐性乳房炎的乳汁的电导率均高于正常值，但不同的个体及不同的饲养管理状况，乳汁电导率变化较大，因此判断隐性乳房炎的关键是确定不同牛群正常乳汁的阈值。西北农林科技大学研制出的XNDA型奶检仪，是以导电极为传感器的便携式奶检仪，它体积小，能快速、综合的检出掺假奶、酸败乳和乳房炎乳。
3.5 乳清电泳诊断法
西南农业大学宋宣明、北京农业大学艾晓杰等在1990年设计出用牛乳清电泳的变化来诊断隐性乳房炎的方法，这种方法较为直观、准确。
3.6 酶检验法
Ishikawa和Kitchen研究证实，乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)主要来自被损害的上皮细胞和大量的乳汁白细胞。LDH活性增加反映了白细胞大量聚集的炎症过程和乳腺组织的损害程度。黄利权等研究发现，不同的乳房炎病原微生物感染乳腺时呈现不同的酶象变化，与阴性感染的乳腺相比，LDH、ACP、GOT和GPT的活性均增强。另外，祁克宗等试验证明隐性乳房炎患牛乳中过氧化物显著高于正常乳，可作为诊断牛隐性乳房炎的酶学指标。髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)在炎症中具有高特异性和可检测性[14]，因此MPO在隐性乳房炎检测中具有重要作用[15]。乳房炎时，一些蛋白酶类，如过氧化物酶、凝固酶、C反应蛋白、间质金属蛋白酶 (MMP2、MMP9)，分析乳汁中MPO的量，就可以确定奶牛是否患隐性乳房炎[16]。另外，检测N乙酰βD氨基葡萄糖甙酶 (NAGase)，也常用于隐性乳房炎的诊断。
3.7 PCR检测法
Phuektes P等[17]建立了一种以16 S～23 S rDNA间隔区为扩增靶序列的多重PCR检测方法，试验检测了117份亚临床感染奶牛乳样，结果均为阳性，表明其具有极大可靠性。同时证实了金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和乳房链球菌4种菌为主要的乳房炎病原菌。Gillespie B E等[18]报道，多重实时PCR检测方法有望直接从乳汁中对金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和乳房链球菌进行同步鉴定。吴润等[19]基于细菌16 S rRNA和(或)23 S rRNA序列设计引物，利用PCR的方法鉴定出了奶牛隐性乳房炎的主要病原茵，包括金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和无乳链球菌。谢志勤等[20]根据金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠埃希菌各自保守的16S或23S rRNA基因序列，合成了3对特异性引物，建立了三重PCR检测方法。特异性试验表明，该方法对所有参与测试的金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和大肠埃希菌都能扩增出各自的阳性条带，而对所有参与测试的对照菌株则不能扩增出任何条带。敏感性试验表明该方法能检测到4个菌的金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和2个菌的大肠埃希菌。杨东英等[21]利用PCRRFLP技术初步证实了奶牛BoLADRB3基因多态性与乳房炎有一定相关性。
3.8 被毛微量元素检测法
根据国内外通过检测人、动物毛发微量元素来诊断疾病的报道，人们希望建立一种通过检测奶牛牛毛中微量元素的含量来检测乳房炎的方法。顾有方等[22]研究发现隐性乳房炎奶牛被毛中的Zn、Cu、Mn的含量比正常牛只有一定相关性。与商常发等发现的隐性乳房炎病牛被毛中Zn、Ca显著低于正常牛被毛有一定差异。同时，由于季节、营养、个体差异等的影响，该诊断方法不太准确，有待进一步研究。
3.9 蛋白质组学检测法
蛋白质组学(Proteomics)是功能基因组学的重要组成部分，在功能基因组学研究中具有举足重轻的地位。近年来对白细胞蛋白质组学(leukocytes proteomics)、病原微生物蛋白质组学(Proteomics of microbial pathogens)、差异蛋白质组学(differential proteomics)等的研究有了突破性进展，使得蛋白质组学在乳房炎的诊断中显得日益重要。曹随忠等[23]报道了蛋白质组学在乳房炎研究中的应用。
4 隐性乳房炎的预防
隐性乳房炎是一种易感染难治愈的疾病，预防尤为重要，奶业发达国家都制定了合理的防制计划，严格执行、并长期坚持，取得了良好的效果。目前，乳房炎的预防措施主要有如下几种。
4.1 加强饲养管理，提高预防效果
注意挤奶卫生，保持牛体卫生清洁，尤其是乳房要清洁、干燥；每次挤奶后进行乳头浸浴，浸液浸没整个乳头即可；干奶期预防，每头母牛的泌乳末期所有乳区都要注入抗生素；加强犊牛、后备牛的培育，淘汰隐性乳房炎病牛，排除感染源；保护牛群的“封闭”状态，避免因牛的引进或出入带来新的感染源；定期评价挤奶机的性能，要保持挤奶杯的清洁，及时更换易损坏的挤奶杯“衬里”，因其容易“滑脱”而造成感染；定期进行牛奶SCC检查，根据细胞数目采取相应的防治措施[9]。同时提高营养水平，增加青绿、青贮料饲喂量，改善畜舍环境，使畜舍通风良好，在乳房炎高发季节定期进行消毒。牛床、垫草及时清扫更换，挤奶器具定时清洗消毒。
4.2 接种乳房炎疫苗
免疫接种控制传染病是一种经典的预防手段，利用疫苗防治奶牛乳房炎不仅有助于降低乳腺感染的严重程度，控制隐性乳房炎，而且没有药物残留，保证乳品的卫生质量。乳房炎疫苗包括灭活疫苗、代谢产物和亚单位苗、活苗等类型。目前已研制出金黄色葡萄球菌疫苗、大肠埃希菌(O111：H4)J5基因工程苗以及金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌的多联苗[24]。另外，佐剂和接种方式也影响免疫效果。
4.3 细胞因子免疫
细胞因子(cytokines，CK)是一些免疫细胞分泌的非免疫球蛋白非补体的免疫活性成分。CK可促进机体细胞特别是免疫细胞的生物学活性、增强机体的天然防御机能，如粒细胞集落刺激因子、INFγ等[25]。陈德坤等[26]应用TAK免疫增强剂对隐性乳房炎奶牛也有较好的疗效，尤其可使肌注组奶牛产奶量明显增加，且肌注组和乳注组的头阳性率分别比治疗前下降了21.6%和16.7%。TAK免疫增强剂属于纯生物制剂，具有调节机体淋巴细胞和巨噬细胞活性、改善机体免疫功能和天然防御机能的作用。
4.4 药物防治
4.4.1 内服盐酸左旋咪唑 在泌乳期添加驱虫药盐酸左旋咪唑，具有免疫调节作用，可以帮助牛恢复正常的免疫功能。葛长海等用左旋咪唑制剂防治奶牛隐性乳房炎，奶牛发病率从66.66%下降到36.11%，牛奶的产量也有所提高。伊岚等[27]报道了奶牛乳房炎MTT法检测方法的药敏试验研究，对抗生素的筛选提供了可行方案。
4.4.2 添加亚硒酸钠或补充维生素E 奶牛补硒或日粮中添加维生素E，可以提高机体抵抗力，降低乳房炎的发病率，尤其在缺硒地区。向湘春等在奶牛日粮中添加亚硒酸钠维生素E粉，奶牛隐性乳房炎头阳性率由55.71%降下降到38.57%。乳区阳性率由33.21%降到17.71%。在奶牛日粮中添加维生素E，奶牛隐性乳房炎头阳性率、乳区阳性率都下降。
4.4.3 中药防治 中药是我国的传统医药。中药不但可以治愈各种疾病，而且能够特异性或非特异性地增强动物机体的免疫力，降低奶牛隐性乳房炎的发病率。张淼涛等研究表明，中药能够明显增强淋巴细胞的刺激指数、提高中性粒细胞的吞噬力。金凤等[28]报道，用党参、黄芪、当归等中药治疗奶牛隐性乳房炎，药效较好。张敬礼等[29]自拟中草药配方治疗隐性乳房炎，以15 d为一个疗程，可使一般的隐性乳房炎治愈率达83.3%，且产奶量有所增加。
目前，奶牛隐性乳房炎多是由于饲养管理不当，环境因素不良造成的，预防奶牛的隐性乳房炎应该重视环境卫生、牛体卫生和乳房清洁。同时坚持预防为主，防治结合的方针，降低隐性乳房炎发病率，减少经济损失及其对人畜的危害，加快推进畜牧业现代化建设。