靶向硫酸庆大霉素的制备及体外抗菌试验

摘要：将硫酸庆大霉素与抗大肠埃希菌抗体用化学修饰剂进行偶联，再经化学方法处理，按制剂学原理制备成靶向硫酸庆大霉素。用硫酸庆大霉素做对照，进行体外抗菌试验，检测靶向硫酸庆大霉素对大肠埃希菌的抗菌效果。结果表明，靶向硫酸庆大霉素的最低抑菌浓度(MIC)为0.02μg/mL，硫酸庆大霉素的最低抑菌浓度(MIC)为0.4 μg/mL，靶向硫酸庆大霉素的抑菌效果明显优于硫酸庆大霉素。

关键词： 靶向硫酸庆大霉素；大肠埃希菌；最低抑菌浓度

靶向给药系统(targeting drug deliverysystem，TDDS)或称靶向制剂，诞生于20世纪70年代。早期的TDDS主要是针对癌症的治疗药物，随着研究的深入，TDDS被扩展到“运载”多种药品来治疗不同疾病，高分子与药物偶联是靶向药物研究中的重要方向之一[1­5]。本研究通过将硫酸庆大霉素与抗大肠埃希菌抗体偶联，制备出专一针对大肠埃希菌的兽用靶向硫酸庆大霉素，由抗大肠埃希菌抗体寻找和捕捉大肠埃希菌，由硫酸庆大霉素抑制和杀灭大肠埃希菌，使其对大肠埃希菌进行“精确打击”，以此增强硫酸庆大霉素的抗菌效果，从而在对动物大肠埃希菌病的治疗上，减少硫酸庆大霉素的用药量和降低其毒副作用，以期达到高效、低毒、低残留的目的。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1 药物与试剂　硫酸庆大霉素原粉由湖南金方堂药业有限公司提供；抗大肠埃希菌抗体为自制，用大肠埃希菌灭活疫苗免疫家兔制得。

1.1.2　菌种　大肠埃希菌购自湖南省微生物研究所。

1.1.3　培养基　普通琼脂和肉汤培养基，按常规方法配制。

1.1.4　主要仪器　超净工作台(SW­CJ­2FD型，苏州净化设备公司)、恒温恒湿培养箱(LRH­250­S，广东省医疗器械厂)、全自动立式电热压力蒸汽灭菌器(YXQ­LS­50SⅡ，上海博迅公司医疗设备厂)、移液器、电子天平、培养皿。

1.2　方法

1.2.1　靶向硫酸庆大霉素药液的制备　参照文献[6­9]，按5∶1比例称取化学修饰剂和硫酸庆大霉素原粉，加入到3mL血清抗体中，再加生理盐水至45 mL，按无菌操作法，在适宜的条件下搅拌，使之充分混合、溶解，于4 ℃冰箱中放置24h后，弃去上清液，将沉淀用450mL生理盐水充分溶解，即制得靶向硫酸庆大霉素溶液，对其性状进行观测，将制备的靶向药物放入冰箱冷藏备用。

1.2.2　硫酸庆大霉素药液的制备　参照文献[10]，称取硫酸庆大霉素原粉0.4 g，定容至100 mL水蒸馏中，制备成4mg/mL的硫酸庆大霉素药液，备用。

1.2.3　体外抑菌试验　参照文献[11]进行。

1.2.3.1　菌液制备　将保存的大肠埃希菌菌种接种于营养肉汤培养基中，37 ℃恒温箱中培养20h后，菌液用生理盐水按10倍顺序稀释，分别接种于琼脂平板，置37 ℃培养20h，计算菌落数目，选择合适浓度将菌液稀释使细菌浓度在105 cfu/mL～106 cfu/mL，备用。

1.2.3.2　最低抑菌浓度(MIC)测定　采用试管10倍稀释法。设A、B两组试管，每组11支，按顺序编为1号～11号，各试管均加入4.5mL稀释菌液(菌液浓度为 105 cfu/mL～106 cfu/mL)，在A组的1号试管中加入0.5mL制备的靶向硫酸庆大霉素药液，在B组的1号试管中加入0.5mL制备的硫酸庆大霉素药液，均按10倍稀释法稀释至第8管，每组均设药物对照管、菌液对照管和空白对照管，置37℃恒温箱中培养，以目测法与对照组比较，如加入细菌的药液试管仍为澄清，即表示无细菌生长，则该管药物浓度有抑菌作用；如为混浊，即表明细菌已生长，该浓度药物无抑菌作用。以完全无细菌生长的最低药物浓度作为细菌对该药物的敏感度，即为该药物MIC。

1.2.3.3　最小杀菌浓度(MBC)的测定　采用平皿菌落计数法。将A、B两组无菌生长的试管中的混合液分别取0.1mL接种于平皿琼脂培养基上，置37 ℃恒温箱中培养20h，菌落计数，低于5个的平皿所对应的药物浓度为该药物的杀菌浓度，浓度最低者即为该药物MBC。

2　结果

2.1　制备的靶向硫酸庆大霉素药液为澄清透明溶液，其pH在5.5～6.5之间，靶向制剂中硫酸庆大霉素的含量为2 mg/mL。

2.2　将制备的靶向硫酸庆大霉素、抗大肠埃希菌抗体及抗大肠埃希菌抗体、硫酸庆大霉素与化学修饰剂的混合物分别进行非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果见图1。

A.蛋白分子质量标准； B.抗大肠埃希菌抗体； C.靶向硫酸庆大霉素； D.抗大肠埃希菌抗体、硫酸庆大霉素及化学修饰剂的混合物

A.Protein Marker；B.Antibody against E.coli； C.Targeted gentamicinsulfate；D.The mixture of antibody against E.coli，gentamicin sulfateand chemical modified agentia

图1 聚丙烯酰胺凝胶电泳

Fig.1 Polyacrylamide gel electrophoresis

从非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图片中可以看到，在蛋白Marker、抗大肠埃希菌血清抗体及抗大肠埃希菌血清抗体、硫酸庆大霉素与化学修饰剂的混合物的电泳中均出现抗大肠埃希菌抗体的条带，但是在靶向硫酸庆大霉素的电泳中抗大肠埃希菌抗体的条带却消失了(图中箭头1所示)，而在分子量更大的位置出现了一条其他电泳液中没有出现的条带(图中箭头2所示)，说明抗大肠埃希菌抗体、硫酸庆大霉素及化学修饰剂发生了结合，形成了比抗大肠埃希菌抗体分子量更大的复合物。

2.3　大肠埃希菌血清抗体和靶向硫酸庆大霉素电镜扫描观察结果，见图2和图3。

图2　抗大肠埃希菌抗体电镜观察

Fig.2　Observation of antibody against E.coli under electronmicroscope

图3　靶向硫酸庆大霉素电镜观察

Fig.3　Observation of targeted gentamicin sulfate under electronmicrosope

2.4　靶向硫酸庆大霉素药液的最低抑菌浓度及最小杀菌浓度见表1和表2。

表1　最低抑菌浓度

Table 1　Minimal inhibitory concentrationmg/mL

注：①A组为靶向硫酸庆大霉素药物的浓度；②对照组为硫酸庆大霉素药物的浓度； ③“－”表示细菌生长受抑制，培养液清亮；④“＋”表示有细菌生长，培养液混浊。

Note： ①Group A is concentration of Targeted GentamicinSulfate；②Control is concentration of Gentamicin Sulfate；③“－”Implybacterium growth was inhabited，the culture medium clarity； ④“＋”Imply bacterium growth， the culture medium turbidity.

表2　最小杀菌浓度

Table 2　Minimal Bactericidal Concentrationmg/mL

注：①A组为靶向硫酸庆大霉素药物的浓度；②对照组为硫酸庆大霉素药物的浓度；③“－”表示无细菌生长。

Note： ①Group A is concentration of targeted GentamycinSulfate；②Control is concentration of Gentamycin Sulfate；③“－”Implyno bacterium growth.

由表1和表2可知，靶向硫酸庆大霉素药液的MIC为0.02μg/mL，平皿培养各培养皿均无细菌生长，各抑菌浓度均呈现杀菌效果，MBC为0.02 μg/mL；硫酸庆大霉素药液的MIC为0.4μg/mL，平皿培养各培养皿上的菌落数均多于5个，不呈现杀菌效果。

3　讨论

靶向硫酸庆大霉素具有很好的体外抑菌作用和强大的体外杀菌作用。硫酸庆大霉素与抗大肠埃希菌抗体偶联后，由于抗大肠埃希菌抗体能特异性地与大肠埃希菌结合，由抗大肠埃希菌抗体携带的硫酸庆大霉素能更好地发挥其抗菌作用，呈现良好地抑菌和杀菌效果，其抑菌和杀菌效果均优于单纯的硫酸庆大霉素。靶向硫酸庆大霉素对大肠埃希菌的作用具有药量小、效果好和作用完全等特点，有很好的开发、应用价值。至于靶向制剂对大肠埃希菌的抗菌机理，还有待进一步研究。