摘 要：在建立吡喹酮含量测定方法的基础上，通过葡聚糖凝胶柱色谱法、显微镜法、激光散射法等定性及定量方法考察脂质体的包封率、微粒外观、粒径及其分布等指标。首先单因素对脂质体制备方法、表面活性剂种类进行筛选，确定影响制备脂质体的主要因素，然后通过优化手段筛选最佳处方及工艺，并制备PEG表面修饰吡喹酮脂质体。优化后的脂质体其包封率在72%以上，体积粒径范围200nm～300 nm，电镜结果显示，脂质体外观圆整而均匀。结果表明，按本处方制得的吡喹酮长循环脂质体包封率高，制备工艺简单，重现性好。
关键词：吡喹酮；长循环脂质体；包封率
血吸虫病是一种危害严重的人畜共患寄生虫病，全世界约有2亿人遭受感染，是世界卫生组织(WHO)重点防控的疾病之一[1]。吡喹酮(Praziquantel，PZQ)为杂环吡嗪异喹啉化合物，是一种高效、广谱的抗血吸虫和抗绦虫药。目前临床应用的吡喹酮制剂有片剂和胶囊。但是，吡喹酮口服首过效应强，生物利用度低。而脂质体(Liposome，Lip)近年来被喻为“药物导弹”，它能使药物在体内缓慢地释放，有效地延长生物半衰期，并能提高药物疗效，降低毒副作用[23]。然而，由卵磷脂(Soybeanlecithin，PC)和胆固醇(Cholesterin，Chol)等组成的传统脂质体是热力学不稳定体系，在体内外的弱稳定性限制了它的使用，极大的影响了其作为药物载体的应用。长循环脂质体(longcirculationgliposomes)是一种经表面修饰，提高体内稳定性的新型脂质体[4]。本试验采用聚乙二醇4000(PEG4000)作为表面修饰剂，制备长循环吡喹酮脂质体，旨在使吡喹酮在肝脏局部具有较高的药物浓度和更长的存留时间，达到提高吡喹酮防治血吸虫病的抗虫指数和降低毒性之目的。
1 材料与方法
1.1 药品和试剂
大豆卵磷脂为进口分装；吡喹酮原料为南京制药厂产品；聚乙二醇4000、聚乙二醇6000(PEG6000)、聚乙烯醇(PVA)为长沙欧迈生物科技有限公司产品；胆固醇、氯仿、吐温80(Tween80)及其余药品、试剂均为分析纯。
1.2 主要仪器
JA10T型透射电子显微镜(日本Hitachi公司)；Malvern2000型激光散射粒径分析仪(英国Malvern公司)；RE52型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；UV2100型紫外/可见光分光光度计(北京莱佰泰科仪器有限公司)；JY9830型超声处理机(宁波新芝生物科技有限公司)；SHBB95型真空泵(郑州长城科工贸有限公司)。
1.3 制备方法的选择
吡喹酮在乙醇中微溶，在水中不溶。参照文献[56]，根据药物的性质，采用逆相蒸发法(ReversePhaseEvaporation)、乙醚注入法(Ether injection)、薄膜超声法(Filmultrasoundmethod)作为吡喹酮脂质体的制备方法，以脂质体的粒径(Particle size，PS)、包封率(Entrapmentefficiency，EW)作为指标，衡量并比较两种方法的优劣。
1.4 表面活性剂种类的选择
在制备脂质体的过程中加入适当的表面活性剂，能够抑制药物在制备过程中的析出，同时能够降低脂质体表面与血清成分特别是调理素的相互作用，从而增加脂质体在体内的存留时间[78]。本试验选择的材料有PVA、Tween80 、PEG4000、PEG6000，将上述表面活性剂和脂质体材料一起溶解制备吡喹酮长循环脂质体，通过激光粒度分析仪测定脂质体的粒径。
1.5 吡喹酮长循环脂质体的形态观察与粒径分析
取脂质体样品适量，滴在有支持膜的铜网上，用磷钨酸进行负染，在透射电子显微镜2万倍下观察并摄制照片，采用激光散射粒径分析仪采样测定脂质体。
1.6 吡喹酮长循环脂质体的包封率测定
1.6.1 标准曲线绘制 精密称取吡喹酮25 mg溶于无水乙醇中，定容至50 mL，得0.5 mg/mL的吡喹酮溶液。精密吸取该溶液1、2、4、6、8 mL，分别置于100mL的容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度。得浓度为0.005、0.01、0.02、0.03、0.04mg/mL的溶液，用无水乙醇作参比，在波长为264 nm处下测定其吸收度。以吸收度对浓度进行线性回归，求回归方程。
1.6.2 包封率测定 采用葡聚糖凝胶(Sephadex)柱色谱法[9]，精密吸取吡喹酮脂质体混悬液0.5mL上柱，以PBS溶液为流动相洗脱，控制流速，每1.0 mL收集一试管，流出液管数与A值曲线见图1。
图1 吡喹酮脂质体洗脱曲线
Fig.1 The separation curve of liposome and free praziquantel
根据Sephadex G50对大分子先被洗脱出来，小分子后出来的顺序，收集合并游离的吡喹酮于100mL容量瓶中，加PBS液定容，摇匀，于264 nm处测定A值，计算游离吡喹酮含量。另精密吸取吡喹酮长循环脂质体混悬液0.5mL，置100 mL容量瓶中，加无水乙醇破膜并定容至100 mL，用0.45 μm的微孔滤膜滤过除去脂质体碎片，取滤液，于264nm处测定OD值。分别将所测吸光度代入回归方程，求得药物含量，按下式计算包封率：
包封率＝1－游离药物含量/系统中的药物总含量
1.6.3 回收率试验 精密称取吡喹酮精制品适量，
加入空白脂质体中，按“1.6.2”项下方法洗脱，收集合并游离的吡喹酮于100 mL容量瓶中，加PBS液至刻度，于264nm处测定OD值，计算回收率。
1.7 正交设计优化吡喹酮长循环脂质体处方和制备工艺
通过采用不同的制备方法，选用不同的表面活性剂制备了吡喹酮长循环脂质体，其包封率与粒径测定的结果表明，采用薄膜超声法选用PEG4000作为表面活性剂制备的脂质体的包封率较高，粒径适当。因此，本试验采用薄膜超声法，使用四因素四水平的正交设计筛选脂质体制备的最优条件，以确定最佳制备工艺。主要的影响因素和水平见表1。
2 结果
2.1 不同制备方法对吡喹酮长循环脂质体的影响
在条件相同的情况下，分别采用逆相蒸发法、乙醚注入法、薄膜超声法制备的脂质体各项指标见表2。
结果表明，乙醚注入法简单，但粒径大，包封率低；逆相蒸发法包封率较高但是粒径较大，稳定性亦较差；薄膜超声法摸索出适宜的温度和超声时间后重现性好，条件易控制，且粒径小，包封率高。为了达到理想的粒径和包封率，本试验采用薄膜超声法作为脂质体制备方法。
2.2 表面活性剂种类对脂质体平均粒径的影响
采用薄膜超声法作为脂质体制备方法，在制备时加入等量比的表面活性剂得到不同的吡喹酮长循环脂质体，见表3。
由表3可见，所选择的材料均能得到脂质体。脂质体粒径的大小影响其在体内的稳定性，大的脂质体缺乏血管通透性，不能通过肝血管的细胞间隙，易被单核巨噬细胞系统吞噬，故在体内的半衰期较短，而小于300nm的脂质体则可以减少肝、脾的摄取[10]，所以选择PEG4000作为制备吡喹酮长循环脂质体的附加剂。
2.3 吡喹酮长循环脂质体的形态和粒径分布
通过2万倍透射电镜观察脂质体的形态，激光粒度分析仪测定脂质体的粒径，见图2。
结果表明，脂质体呈球型，粒径分布窄，均匀圆整，分散性好，无药物结晶出现，粒径为200 nm～300 nm者占70%,300nm～400 nm者占15%，400 nm～500 nm者占10%,500 nm以上者占5%，体积平均粒径为233 nm。
表1 正交设计试验因素和水平表
Table 1 Factor and levels for orthogonal test
水平 Level | 因素 Factors | |||
磷脂∶胆固醇 PC∶Chol A | 磷脂∶吡喹酮 PC∶PZQ B | 磷脂∶聚乙二醇4000 PC∶PEG 4000 C | 磷酸盐缓冲液 PBS D | |
1 | 1：10 | 4∶1 | 1∶1 | pH 6.8 |
2 | 1∶15 | 6∶1 | 2∶1 | pH 7.0 |
3 | 1∶20 | 8∶1 | 3∶1 | pH 7.4 |
4 | 1∶25 | 10∶1 | 4∶1 | 生理盐水 Normal saline |
表2 3种方法制备的吡喹酮脂质体各项指标
Table 2 Index of praziquantel liposome in three methods ofpreparation
吡喹酮长循环脂质体 Longcirculating praziquantel liposome | 逆相蒸发法 Reversephase evaporation | 乙醚注入法 Ether injection | 薄膜超声法 Filmultrasound method |
平均粒径/nm Average diameter | 801.60 | 656.32 | 253.41 |
包封率/% Entrapment rate | 54.23 | 32.18 | 75.54 |
Table 3 The effects of different surfactants on diameter oflongcirculating praziquantel liposome
表面活性剂 Surfactants | 平均粒径/nm Average diameter | 融合情况 Fusioncondition |
Tween80 | 846.48 | 少部分有融合 A small number of fusion |
PEG4000 | 233.52 | 极少量融合 Very small numbers of fusion |
PEG6000 | 560.36 | 少量融合 Few fusion |
PVA | 1 020.40 | 大部分聚集成团 Most gathered into mission |
图2 吡喹酮长循环脂质体的电镜照片
Fig.2 The electronic microscope photograph of longcirculatingpraziquantel liposome
2.4 标准曲线及回收率
2.4.1 标准曲线 结果表明，吡喹酮在5 μg/mL～40μg/mL浓度范围内药物溶液浓度与其相对应的吸光度呈良好的线性关系，回归方程为：OD＝31.833 0 C＋0.0208，r＝0.999 7。
2.4.2 回收率 结果平均回收率为(98.81±0.92)%，RSD＝2.26%。
2.5 吡喹酮长循环脂质体处方和制备工艺的优化
根据已确定的四因素四水平，按[L16(44)]正交设计配制16份样品，以包封率为考察指标进行正交试验。由表4可见，4个因素中对吡喹酮长循环脂质体包封率的影响顺序为C>A>B>D，得出优化处方为A3B3C4D3。即m(磷脂)∶m(吡喹酮)＝10∶1；m(磷脂)∶m(胆固醇)＝10∶1；PEG的用量为大豆卵磷脂质量的5%；应选用pH为7.4的PBS液。
表4 正交设计试验结果
Table 4 The result of orthogonal design of experiments
试验号 Experimental number | 因素 Factors | 包封率/% Entrapment rate | |||
A | B | C | D | ||
1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 65.23 |
2 | 1 | 2 | 2 | 2 | 67.47 |
3 | 1 | 3 | 3 | 3 | 72.32 |
4 | 1 | 4 | 4 | 4 | 71.64 |
5 | 2 | 1 | 2 | 3 | 72.38 |
6 | 2 | 2 | 1 | 4 | 67.77 |
7 | 2 | 3 | 4 | 1 | 75.94 |
8 | 2 | 4 | 3 | 2 | 73.05 |
9 | 3 | 1 | 3 | 4 | 74.35 |
10 | 3 | 2 | 4 | 3 | 77.54 |
11 | 3 | 3 | 1 | 2 | 71.37 |
12 | 3 | 4 | 2 | 1 | 71.81 |
13 | 4 | 1 | 4 | 2 | 71.36 |
14 | 4 | 2 | 3 | 1 | 72.29 |
15 | 4 | 3 | 2 | 4 | 74.18 |
16 | 4 | 4 | 1 | 3 | 69.87 |
X1 | 69.17 | 70.83 | 68.56 | 71.32 | |
X2 | 72.29 | 71.27 | 71.46 | 70.81 | |
X3 | 73.77 | 73.45 | 73.00 | 73.03 | |
X4 | 71.93 | 71.59 | 74.12 | 71.99 | |
R | 4.60 | 2.62 | 5.56 | 2.22 |
注：①E为脂质体包封率；②X1，X2，X3，X4分别为各因素不同水平4次实验的平均包封率；③R为各因素不同水平的极差。
Note：①E was the liposomal encapsulation ration；②X1，X2，X3，X4wasrespectively the average encapsulation ratio of three tests for onelevel under different factors； ③R was the range among three levelsunder different factors.
3 讨论
吡喹酮为脂溶性药物，可溶于无水乙醇，不溶于水和乙醚，根据这一性质，本文采用薄膜超声法运用正交设计法配方制备吡喹酮长循环脂质体。在制备的过程中影响PZQLip形成及包封率、含量的因素很多，其中主要因素是大豆磷脂胆固醇的比例，若磷脂用量多，胆固醇用量少，则脂质体的稳定性差；反之，脂质体不易形成；其次是脂质体膜材药物的比例，若膜材用量多，药物量少，虽然脂质体对药物的包封率高，但脂质体的含药量少，造成脂质体膜材的浪费[11]。
PEG在本处方中起抑晶作用，同时能够包裹吡喹酮脂质体，形成表层包衣，这种结构能降低血浆蛋白与细胞表面配体的相互作用，其立体位阻同时屏蔽RES系统对脂质体的识别[12]。并且PEG类脂衍生物因原料易得价格适合无免疫毒性等特点而格外受到重视。使用该处方制得的吡喹酮长循环脂质体包封率较高，为72.54%±0.28%，镜检显示粒径大部分为200nm～300 nm，适用于静脉注射，说明本工艺的方法可行，对吡喹酮长循环脂质体的商品化生产具有一定的指导作用。