犬瘟热病毒Yunnan株H基因的克隆与表达

摘　要：根据已发表的犬瘟热病毒(CDV)Onderstepoort株的序列设计两对引物，以犬瘟热病毒云南株感染的Vero细胞收获病毒提取的总RNA为模板，RT­PCR扩增出H基因的939bp(H基因前段，H1)和920bp(H基因后段，H2)片段，分别将其定向克隆于PET­28a(＋)中，将重组质粒转化宿主菌BL21(DE3)plysS，在35℃、1.0 mmol/L IPTG诱导下获得良好表达，经SDS­PAGE鉴定，表达的融合蛋白为34ku，与预期大小一致。免疫印迹试验显示，该重组蛋白可被CDV Onderstepoort株多克隆抗体识别，表明该重组蛋白具有抗原性。

关键词：犬瘟热病毒；H基因；克隆与表达；免疫印迹

犬瘟热病毒(Canine distemper virus，CDV)，是当前对我国养犬业、毛皮动物养殖业和野生动物保护业危害最大的犬瘟热(Canine distemper，CD)的病原[1]。同时，CDV脑炎又是研究人类脱髓鞘神经紊乱致病机理的重要动物模型[2]。

CDV与麻疹病毒、牛瘟病毒同属副黏病毒科麻疹病毒属，是负链单股不分节的RNA病毒，基因组全长15 690nt，由7个基因组成，分别编码N、P、M、F、H、L蛋白，其中F、H蛋白是诱导机体产生中和抗体及激发免疫性保护应答的主要抗原[3]。H蛋白决定CDV宿主的特异性，并协助F蛋白使CDV以囊膜与宿主细胞膜发生融合的方式进入宿主细胞[4]。在免疫压力作用下，CDV抗原表位可能发生漂移，尤其是较大的H蛋白极易发生变异，从而引起CDV毒力的变化[5­6]。据CamilaP M[7]及NathalieS等[8]报道，H基因具有作为基因工程疫苗或核酸疫苗的备选基因的可能性，提示H蛋白可以用于CDV的预防控制。本研究将CDV云南株H基因分成2个片段(H1和H2)，分别进行基因的克隆、表达，并进行免疫印迹试验，以证实该重组蛋白是否保留了天然H蛋白的关键性抗原表位，为CDV基因工程抗原的制备奠定基础。

1　材料与方法

1.1　毒株、菌株及质粒

犬瘟热病毒Y株、Vero细胞、E.coli JM109、BL21(DE3)plysS、原核表达载体pET­28a(＋)均由本室保存。

1.2　主要试剂

病毒总RNA/DNA提取试剂盒、RT­PCR试剂盒、各种限制性内切酶购自宝生物工程(大连)有限公司；质粒提取试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司。

1.3　病毒扩增及其总RNA提取

犬瘟热病毒Y株按0.1 MOI(感染比)接种Vero细胞，培养5 d～7d后，待80%左右细胞出现细胞病变(CPE)时收获细胞及上清液，冻融3次，20 000 r/min 离心20min，去除细胞碎片，将上清液置于200 g/L的蔗糖溶液上，27 000 r/min离心2 h，取其沉淀用适量PBS悬浮后，－70℃保存备用。参照病毒总RNA提取试剂盒说明提取总RNA。最后将核酸沉淀溶于适量的DEPC处理过的双蒸水中。

1.4　RT­PCR

1.4.1　PCR引物设计　根据已发表的CDV Onderstepoor株的序列，设计合成了两对引物：

P1F：5′­GCAGGATCCATGCTCTCCTACCAAGACAAG­3′

P2R：5′­GCCGAATTCAGCGTCACTACTAGAATACC­3′

P3F：5′­GCAGGATCCATGGGTATTCTAGTAGTGACG­3′

P4R：5′­GCCGAATTCATCTAAGTCCAATTGAGAT­3′

在其5′端引物引入BamHⅠ酶切位点，3′端引物引入EcoRⅠ酶切位点。其中P1/P2用来扩增H1基因的前段，P3/P4用来扩增H2基因的后段，P1/P4扩增H全基因，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，用ddH2O按20pmol/μL稀释，置－20 ℃冻存。

1.4.2　RT­PCR扩增目的基因　以病毒总RNA为模板，应用特异引物扩增H1、H2基因片段和H全基因。PCR反应体系为10×onestep RNA PCR buffer 5 μL，dNTP(各10 mmol/L)5 μL，MgCl2 (25mmol/L/mL)10 μL，引物各1 μL，RNase Inhibitor(40 U/μL)1 μL，Amv XL酶 1μL，Amv Taq酶1 μL，总RNA模板2 μL，加RNase Free H2O至总反应体积为50μL。RT­PCR反应参数：50 ℃45 min；94 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，50 ℃ 30 s,70 ℃ 30s，35个循环；72 ℃ 15 min。4 ℃保存。PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳确定其大小后回收。

1.5　重组质粒的克隆与鉴定

将回收的PCR产物用BamHⅠ和PstⅠ双酶切后回收，按常规方法连接pET­28a(＋)，转化宿主菌BL21(DE3)plysS，鉴定阳性的克隆递交上海生工生物工程技术服务公司测序，以验证其阅读框。

1.6　重组质粒的诱导表达

纯化后的阳性克隆在35 ℃、1.0 mmol/L IPTG诱导表达，SDS­PAGE分析表达产物。

1.7　免疫印迹

按照半干转移法进行，一抗为CDV Onderstepoort株多克隆抗体，二抗为辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG，以DAB显色。

2　结果

2.1　RT­PCR

提取CDV的总RNA，用引物P1P4、P1P2、P3P4对其进行RT­PCR扩增，扩增片段的理论值分别为1 859、939、920bp，PCR产物电泳结果与预计相符(图1)。

2.2　重组质粒的构建

将PCR产物与PET­28a(＋)连接得到的阳性克隆命名为PET­28a­CDVH1、PET­28a­CDVH2(图2)。测序结果表明其序列与已发表的CDVOnderstepoort株序列同源性达99.2%，且阅读框正确。

1.DNA标准DL 2 000；2.引物P1和P4扩增H基因的PCR产物；3.引物P1和P2扩增H基因的PCR产物；4.引物P3和P4扩增H基因的PCR产物

1.DNA Marker DL 2 000；2. PCR products of H gene (P1 and P4)；3.PCRproduct of H gene (P1 and P2)；4.PCR products of H gene (P3 and P4)

图1　犬瘟热病毒H基因RT­PCR扩增结果

Fig.1　RT­PCR amplification products of H gene of CDV

1. DNA标准DL 15000；2.重组质粒pET­CDVH1经BamHⅠ和PstⅠ双酶切结果；3.重组质粒pET­CDVH2经BamHⅠ和PstⅠ双酶切结果；4.DNA标准DL2 000

1.DNA Marker DL 15 000；2.Recombinant plasmid pET­CDVH1 digested byBamHⅠ and PstⅠ；3.Recombinant plasmid pET­CDVH2 digested by BamHⅠand PstⅠ；4.DNA Marker DL 2 000

图2　重组质粒的BamHⅠ和PstⅠ双酶切鉴定

Fig.2　Identification of the recombinant plasmid by restrictiondigestion using BamHⅠ and PstⅠ

2.3　重组质粒的诱导表达

取重组菌裂解物进行SDS­PAGE，结果显示，重组菌约在34 ku处出现一条特异蛋白条带(图3)。

1.pET­CDVH1 /BL21经IPTG诱导5 h；2. pET­CDVH2 /BL21经IPTG诱导5 h；3.BL21经IPTG诱导5 h；4. pET­28a(＋)/BL21经IPTG诱导5 h；5. pET­CDVH1/BL21无IPTG诱导5 h；6. pET­CDVH2 /BL21无IPTG诱导5 h；7.空白；8.蛋白分子质量标准

1. pET­CDVH1 /BL21 induced 5 h with IPTG；2. pET­CDVH2 /BL21 induced5 h with IPTG；3.BL21 induced 5 h with IPTG；4.pET­28a(＋)/BL21induced 5 h with IPTG；5.pET­CDVH1/ BL21 induced 5 h without IPTG；6.pET­CDVH2/ BL21 induced 5 h without IPTG；7.Blank；8.Protein Marker

图3　SDS­PAGE电泳分析表达产物

Fig.3　SDS­PAGE analysis of the expression products

2.4　免疫印迹分析

上述特异蛋白条带可被CDV Onderstepoort株多克隆抗体识别，表明该重组蛋白具有天然H蛋白的抗原性(图4)。

1.蛋白分子质量标准；2.pET­CDVH1表达产物；3.pET­CDVH2表达产物

1.Protein Marker；2. Expressed product of pET­CDVH1；3.Expressedproducts of pET­CDVH2

图4　表达产物的免疫印迹分析

Fig.4　Analysis of the expressed product by Western blot

3　讨论

近年来，随着犬瘟热病毒的自然感染宿主范围的不断扩大，其危害也越来越大。国内外在CDV生态学、生物学特征鉴定、分离株的序列及诊断方面进行了研究，而针对其功能基因克隆表达方面的研究则仅见于CDV参考株的报道[9]。对于可能更具研究价值的临床分离株的研究则未见报道。本研究采用PET­28a高效表达系统成功表达了H全基因编码的蛋白，弥补了对云南分离株研究的空缺。

H蛋白是诱导机体产生中和抗体的主要蛋白之一，是抗CDV免疫的重要抗原，抗CDVH蛋白单克隆抗体(McAb)具有中和病毒活性，对实验鼠的保护力强于抗F蛋白的McAb，抗CDVH蛋白7个抗原决定簇中的6个McAb能中和CDV，阻止CDV的感染。CDV通过H蛋白吸附到细胞表面的受体上，因此，H蛋白决定CDV宿主的特异性，并协助F蛋白使CDV以囊膜与宿主细胞膜发生融合的方式进入宿主细胞，特别在启动细胞融合上起重要作用[10]。由此可见，H蛋白可用于CDV的免疫预防，且具有一定的诊断价值，其抗体可用于CDV感染的诊断或流行病学调查。本研究成功表达了H蛋白，为CDVH基因的进一步研究打下了基础。

SDS­PAGE和Western blot试验表明，H基因两片段的重组融合蛋白分别约34ku，并且具备天然蛋白的关键性抗原表位。可见，虽然原核表达系统不能对表达产物进行糖基化、磷酸化等化学修饰作用，但表达产物可为免疫监测、制备单克隆抗体过程中的筛选和基因工程疫苗提供材料。