硬皮病动物模型及其应用研究进展

摘　要：硬皮病是一种以组织纤维化、闭塞性血管炎和产生大量自身抗体为特征的结缔组织病，病因及发病机制至今尚未完全明了，尚无理想的治疗药物和方法。该文对建立硬皮病模型动物的选择进行了比较，介绍了应用博来霉素诱导Balb/c小鼠产生硬皮病样病变以及应用V型胶原重塑新西兰兔硬皮病样改变等建立硬皮病模型的方法，对应用这两种动物模型研究硬皮病发病机制和中药临床治疗研究概况进行了综述。

关键词：硬皮病；动物模型；应用

硬皮病(Scleroderma，Scl)是一种以皮肤、血管和内脏器官的纤维化，体内产生大量破坏各种细胞成分的自身抗体为特征的结缔组织病，发病有3个基本过程，即纤维化、炎症和血管功能障碍[1]。该病的病因及发病机制至今尚不完全清楚，尚无理想的治疗药物和方法。硬皮病临床基础研究，因患者依从性较差，取材较困难，因此建立合适的硬皮病动物模型，选择合适的模型动物和试验方法，对于阐明发病机制和治疗具有重要意义。

1　硬皮病模型动物的选择

在试验研究中，选择合适的动物建立硬皮病模型，对于病因、发病机制和治疗等具有极其重要的意义。曾有选取紧皮鼠(tight skinmouse)、UCD(University of California atDavis)鸡等可自发产生硬皮病的动物，但因来源困难、操作复杂而很难推广。将博来霉素(bleomycin，BLM)注射于普通小鼠和sprague­dawley 大鼠，其皮肤硬化均不明显，说明普通小鼠和sprague­dawley大鼠并非是硬皮病模型的理想动物[2]。

自发产生和诱导产生硬皮病的动物模型已被广泛研究，虽然没有动物模型能完全重塑硬皮病多器官纤维化、炎症和血管功能障碍三大特征，但可选择性的利用一些动物模型的特征来研究。硬皮病各种动物模型比较见表1。Tsk1/＋小鼠是以弥漫性皮肤肥厚为特征，纯合的Tsk1小鼠发生变异，妊娠8d～10d后死于子宫内，但杂合的Tsk1小鼠生命力很强，并可发育成紧皮鼠，皮肤与皮下组织紧密相连，与人的硬皮病不同的是，Tsk1小鼠皮下组织超常增生，真皮层未受影响，易发展成肺气肿样改变而非纤维化，基本不出现血管病变[3]。Tsk1小鼠皮肤纤维化的机制现在还不清楚，有学者认为纤维组织紊乱是原纤维蛋白­1(fibrillin­1，FBN­1)基因编码变异，通过增加FBN­1的表达所引起，FBN­1可直接调节Ⅰ型胶原蛋白在细胞外基质的合成而导致Tsk1小鼠皮肤纤维化的发生[4]，这与促纤维化的转化生长因子­β(transforminggrowth factor，TGF­β)的高表达有关，FBN­1直接与TGF­β结合或与其蛋白相互作用可调节并激活TGF­β[5]。

表1　硬皮病小鼠模型

Table 1　Mouse models of scleroderma

模型 Models	硬皮病的特征重塑 Reproduction ofkey features of scleroderma
血管病变 Vasculopathy	炎症 Inflammation	自身免疫 Autoimmunity	纤维化 Fibrosis
自发产生 Naturally occurring	Tsk1	－	－	＋	＋
Tsk2	－	＋	＋	＋
诱导产生 Induced	博来霉素 Bleomycin	－	＋	－	＋
移植物抗宿主疾病Ⅰ Graft­versus­host diseaseⅠ	＋	＋	－	＋
移植物抗宿主疾病Ⅱ Graft­versus­host disease Ⅱ	＋	＋	＋	＋
转基因 Transgenic	显性负性TGF­βRⅡ Dominant­negative TGF­βRⅡ	－	＋	－	＋
条件性TGF­βRⅠ Conditional TGF­βRⅠ	＋	＋	－	＋

YamamotoT等[6]用BLM局部注射于Balb/c小鼠背部，成功诱发小鼠皮肤硬化，产生和系统性硬皮病相似的组织病理和免疫组织化学变化，并对不同品系小鼠进行了比较，认为C3H/He和B10.A两种品系小鼠是用BLM诱导硬皮病模型的合适动物。近年来，国内外学者大多都选用Balb/c小鼠建立硬皮病动物模型，均获得成功。赵凯等[7]比较了不同品系的C3H和Balb/c小鼠对BLM诱导皮肤硬化的敏感性。C3H和Balb/c小鼠在博来霉素诱导下均发生皮肤硬化，硬化皮肤厚度及皮肤胶原含量均显著高于对照组(P<0.01)，通过比较发现C3H小鼠在皮肤厚度、胶原含量改变等方面均明显高于Balb/c小鼠(P<0.05)，且产生皮肤硬化的时间短于Balb/c小鼠。应用BLM可在短期内诱导C3H和Balb/c小鼠皮肤硬化，成功建立小鼠皮肤硬化模型。最近，BezerraM C等[8]选用新西兰兔，经人类V型胶原加弗氏佐剂免疫，可诱发器官纤维变性和血管炎，动物皮肤分析显示致敏7d后皮肤增厚及皮脂腺和汗腺萎缩，真皮中有胶原纤维沉积，75 d和120 d后沉积继续增加。

2　建立硬皮病模型的方法

2.1　博来霉素诱导硬皮病样病变

YamamotoT等[6]用BLM局部注射于Balb/c小鼠，在短期内成功地诱导出硬皮病病变，并初步进行了治疗药物的评价，该模型与人的硬皮病有很多相似之处。BLM是治疗恶性肿瘤的常用抗癌药物，用于治疗肿瘤的过程中，其主要的副作用之一是导致肺纤维化，对皮肤的副作用有皮肤纤维化、角化、雷诺现象、色素沉着及脱发等[9]。体外试验表明，BLM可使培养中的皮肤和肺组织成纤维细胞的胶原和纤维黏蛋白的mRNA表达亢进，BLM可刺激人末梢血单核细胞的培养上清液具有使成纤维细胞增殖的作用[6]。

朱鹭冰等[10­13]对C3H小鼠或Balb/c小鼠持续皮下注射BLM的方法成功诱导出硬皮病模型，可致小鼠背部皮肤硬化，表现为皮肤弹性降低，毛发脱落，表皮萎缩，皮肤明显增厚，胶原纤维明显增生，真皮及皮下小血管壁显著增厚，局部皮肤出现均质硬化现象。肺组织学上可见到肺泡间隔增厚，伴有巨噬细胞浸润，间隙中有少量成纤维细胞增生；与注射PBS的对照组相比，皮肤胶原含量、皮肤Ⅰ、Ⅲ型胶原免疫组织化学指数显著增高，皮肤TGF­β1、TGFβ2 和α­SMA表达增强，这些均与人的硬皮病改变相似，该模型由于是用药物诱导的硬皮病，与人硬皮病发病呈进行性发展模式可能有所不同。用BLM诱导的硬皮病模型可维持相当长的时间，YamamotoT等观察小鼠停止注射BLM6周，皮肤硬化仍旧存在。朱鹭冰等[10]观察到停止注射BLM后2个多月，小鼠皮肤硬度、厚度及胶原纤维含量较模型初建时仍无明显改变。

用BLM诱导Balb/c小鼠建立硬皮病模型操作简便，重复性亦好，应用BLM建立硬皮病小鼠模型的方法得到肯定，但是剂量的应用各不相同。因此，制作硬皮病小鼠模型时要注意选择BLM的适当剂量，国内外学者大多选用浓度200μg/mL的BLM复制硬皮病模型并获得成功。Yamamoto T等[6]分别用100 μg/mL和1 mg/mL浓度的BLM注射于Balb/c小鼠背部皮肤，均成功诱发局部皮肤硬化。屠文震等[11]用1 mg/mL的BLMPBS液注射2周后发现Balb/c小鼠除出现局部皮肤增厚外，出现浅溃疡，且逐日加重，认为BLM的浓度以100 μg/mL～200μg/mL为宜，博来霉素剂量≤10 μg/d 时，不能诱导出小鼠硬皮病样改变，在100 μg/d的剂量时可以诱导出轻度硬皮病样改变，而在1 mg/d 的剂量时诱导硬皮病样改变的效果最好[13]。

2.2　Ⅴ型胶原重塑硬皮病样改变

Bezerra MC等[8]发现经人类Ⅴ型胶原加弗氏佐剂免疫的新西兰兔可发生器官纤维变性和血管炎，而这是系统性硬化病的特征表现。研究了微纤维形成过程，以明确这种硬皮病样模型中重塑变化的可能因素。对雌性新西兰兔(n＝10)给予2次1mg Ⅴ型胶原(COL Ⅴ)加完全弗氏佐剂间隔30 d皮下注射，随后给予2次附加的不完全弗氏佐剂间隔15d肌内加强免疫。对照组动物(n＝10)仅接种了与COLⅤ状态相同的完全和不完全弗氏佐剂。采用Masson三色染色法和免疫荧光法对动物和硬皮病患者皮肤进行组织学分析，分析显示致敏7d后真皮中有胶原纤维沉积，75 d和120d后沉积继续增加，在处死的动物中皮肤增厚及皮脂腺和汗腺萎缩更为加剧，且与胶原沉积量的增加相关。硬皮病患者和动物的Ⅴ型胶原均过度表达，在真皮中形成密集的非典型胶原纤维，这种形态学异常的Ⅴ型胶原的过表达可解释硬皮病样斑块的重塑。CalladoMR等[14]等用同样的方法成功诱导出硬皮病样改变，组织病理学显示细胞外基质重塑纤维化和血管病变，并用ELISA法检测硬皮病的标志抗Scl­70抗体，免疫30d后可在血清中检测到抗体。

3　应用研究

硬皮病动物模型的建立，对于阐明发病机制和治疗具有重要意义。廖朝晖等[12]在BLM诱发硬皮病小鼠模型的过程中，发现结缔组织生长因子(connectivetissue growth factor，CTGF) 是调控pro­COL1A1基因转录的重要因素之一，在人类硬皮病细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的过度沉积中发挥着重要作用。Iwasaki T等[15]研究了肝细胞生长因子(hepatocyte growthfactor，HGF)基因转染在紧皮鼠皮肤和肺的纤维化的作用，发现HGF基因转染对纤维蛋白生成有重要作用，有效的改善了皮肤硬化，可作为硬皮病的一种新型治疗方法。黎智等[13]将phVEGF165质粒导入BLM诱导的硬皮病小鼠模型背部皮肤，观察VEGF对硬皮病小鼠模型毛发生长的作用，发现VEGF对硬皮病小鼠模型毛囊的再生及毛发的生长有明显的促进作用，phVEGF165质粒导入的小鼠皮肤毛囊数目明显增多，真皮及毛囊区VEGF及VEGF mRNA 表达增强。

在中医药治疗硬皮病的研究中，硬皮病模型的应用较为广泛。钱先等[16]对8周龄Balb/c小鼠用BLM制作硬皮病模型，探讨中药补肺清瘀颗粒对硬皮病模型小鼠皮肤软化的作用，用不同剂量的补肺清瘀颗粒治疗26d后，发现补肺清淤颗粒低、中、高剂量均有改善硬皮病模型小鼠真皮增厚的趋势，中、高剂量能减轻真皮小血管周围炎，缓解附属结构毛囊、汗腺的减少或缺失。李桂等[17]用BLM皮下注射建立硬皮病小鼠模型，研究五痹胶囊对硬皮病小鼠模型的影响，灌胃给予不同剂量的药物，结果显示各治疗组小鼠皮肤硬化程度可得到一定的改善，皮肤厚度变薄，胶原含量减少，随剂量的增大呈剂量­效应关系，与模型组比较有显著性差异(P<0.01)。朱鹭冰等[18]将温阳活血方及丹参应用于博来霉素诱导的硬皮病小鼠模型，研究温阳活血方及丹参对硬皮病小鼠模型的影响，用药小鼠分成早期给药组和硬化后给药组，分别口饲温阳活血方、口饲丹参和静脉注射丹参，结果发现早期给药组小鼠随用药时间的递增、皮肤硬化得到明显改善，其中又以口饲温阳活血方组、静脉注射丹参组改善效果更明显，硬化后给药组小鼠皮肤硬化也改善明显。

综上所述，自发产生和诱导产生硬皮病的动物模型已被广泛研究，虽然没有动物模型能完全重塑硬皮病多器官纤维化、炎症和血管功能障碍三大特征，但可选择性的利用动物模型所产生的特征来研究，对于阐明硬皮病的发病机制和治疗具有重要意义。