摘 要：慢病毒能够感染分裂细胞和非分裂细胞，因而被发展成为重要的转基因载体，已成为制备转基因动物的一种工具，转基因效率明显提高。该文介绍了制备转基因动物的技术方法，比较了慢病毒载体制备转基因动物的特点和优势，介绍了慢病毒载体安全设计的发展，并将近年来国内外利用慢病毒载体法制备转基因动物的研究进行了概述。
关键词：慢病毒；转基因动物；安全性
慢病毒属于逆转录病毒科。慢病毒感染宿主细胞后，病毒RNA反转录为DNA后可以整合到宿主细胞的染色体上并长期稳定表达。与其他逆转录病毒相比，慢病毒不但能感染分裂细胞，还能感染静止细胞，因此成为有效的基因转移载体。近几年来，研究人员利用其特性，用慢病毒载体技术进行了转基因动物研究，取得了一些进展。
1 制备转基因动物的技术方法
1974年Jaenisch等将猿猴的空泡病毒核酸注入小鼠的胚泡，培养出转基因动物；1980年Gordon等首次将克隆的基因注入小鼠受精卵原核，然后移植于假孕的母鼠输卵管，培育出转基因动物；1982年美国科学家Palmiter等将大鼠生长激素(GH)基因导入小鼠受精卵雄性原核中获得超级转基因鼠。这种将外源性基因用试验方法插入动物生殖细胞的基因组而获得具有插入基因特性，并能正常繁衍的动物称为转基因动物( transgenicanimals)。转基因技术已渗透到生物学、医学、畜牧兽医学等领域，转基因动物已成为探讨基因调控机理、致癌基因作用和免疫系统反应的有力工具。同时人类遗传病的转基因动物模型的建立，为遗传病的基因治疗打下坚实的理论基础。
近年常规的转基因技术主要有显微原核注射法，逆转录病毒感染法，胚胎干细胞介导法，精子载体法，体细胞核移植转基因法，人工酵母染色体(YAC)法，还有电脉冲法、畸胎肿瘤细胞介导法、磷酸钙沉淀法、高效微弹轰击法等。显微原核注射法是最常用的转基因方法，而慢病毒载体技术属于逆转录病毒载体法。
2 显微原核注射法和逆转录病毒载体法
显微原核注射法是最常用的转基因方法，在实际应用中有以下不足： ①价格昂贵，整合率低。此方法需要有丰富的劳力资源、复杂的显微操作、昂贵的试验设备， 而且整合率极低， 在小鼠上所获得转基因动物仅是注射卵的1% ，在大家畜和其他动物更低； ②整合有较大的随机性， 也不能定点整合。当外源基因被注入到原核后，可以插入到受体染色体基因组任何一个的部位，完全随机，所以基因的表达和遗传稳定性得不到保证。
逆转录病毒感染法是将目的基因重组到逆转录病毒RNA载体上，制成高滴度的病毒颗粒， 人为感染着床前或着床后的胚胎，也可以让胚胎与能释放逆转录病毒的单培养层细胞共孵育以达到感染的目的。逆转录病毒RNA 进入宿主细胞后， 被反转录为DNA ，并在整合酶和其末端特殊核酸序列作用下，整合到宿主细胞的基因组，进行表达和遗传得到转基因动物。逆转录病毒感染法优于微注射法，一是方法比较简单，无需昂贵的显微操作仪器，二是效率较高，无导入基因的连环化现象，可引入单拷贝的基因。缺点是需要生产带有转基因的逆转录病毒；插入逆转录病毒的基因有一定的大小限度；所得转基因家畜的嵌合性很高，需要广泛的杂交，以建立转基因系；转基因的表达问题尚未解决[1]。
3 慢病毒载体的特点
由于逆转录病毒载体仍存在着宿主范围狭窄，仅能感染分裂细胞，感染效率较低，病毒滴度较低，很容易被血清补体灭活等不足，这些缺点限制了逆转录病毒载体在基因治疗中的广泛运用。基于慢病毒(Lentivirus，LV)能够广泛感染各种非分裂细胞(如神经元，肝细胞和肌细胞等)，其目的基因整合至靶细胞基因组能够长期表达，具有免疫反应小等优点，将成为一个有发展潜力的基因转移载体[24]。
慢病毒为逆转录病毒科的一个属，它包括灵长类慢病毒，如人类免疫缺陷病毒1型(HIV1) 和HIV2，猴免疫缺陷病毒(SIV)和非灵长类慢病毒，如Vis2na 病毒、马传染性贫血病毒(EIAV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)和牛免疫缺陷病毒(BIV)等。慢病毒除了具有一般逆转录病毒gag、pol和env3个基本基因结构外，还包含4个辅助基因， vif、vpr、nef、vpu和2个调节基因tat和rev[5]。
HIV1是慢病毒中最具特征性的病毒，第1个LV系统即以此病毒为基础进行构建的。它为RNA双链分子，其单链由9749个核苷酸组成，共有9个基因，除包括与简单逆转录病毒相同的gag、pol和env3个编码病毒颗粒的基本结构基因外，还有2个调节基因tat和rev及4个辅助基因vif、vpr 、vpu和nef [6]。gag基因编码病毒的核心蛋白包括p18 (基质蛋白) 、p24 (衣壳蛋白)和p7(核衣壳蛋白)。pol基因编码病毒复制所需的酶类，env基因编码病毒的包膜糖蛋白，决定病毒感染宿主的靶向性。tat及rev基因编码的Tat及Rev蛋白分别在转录及转录后对病毒基因表达进行调控[7]。vif、vpr和nef蛋白插入病毒颗粒中，vpu 参与病毒颗粒的组装。gag编码的基质蛋白，pol编码的整合酶和vpr辅助蛋白形成整合前复合物，本身具有核定位信号，有利于整合前复合物进入靶细胞核，而不完全依赖靶细胞的分裂状态，此为慢病毒可感染非分裂细胞的主要机制。两侧为长末端重复序列(LTR)，内含复制所需的顺式作用元件，其序列为5′U32R2U53′，其中U3区内含3个转录区，即核心区、调节区和增强区。转录起始于U3/R交接处，R的第一个核苷酸编号为1，U3区核心成分中包含一个标准TATA盒及3个SP1结合位点，对基本启动子活性及病毒复制甚为重要。SD为剪接供体位点，ψ为包装信号，它可使RNA包装入病毒蛋白壳内[8]。
4 慢病毒安全设计的发展
慢病毒载体系统已发展到第3代，其安全性已大大增加。第1代慢病毒载体系统是以Trono领导的课题组构建的三质粒系统为代表[9]。该载体系统由包装质粒、包膜质粒及载体质粒组成。将慢病毒载体分成3个质粒，使其共同重叠序列最小化，降低了产生RCV的可能性，同时可获得较高滴度的慢病毒载体[9]，第2代慢病毒载体系统是以自身失活(SIN)的慢病毒载体为代表[10]。删除了U3区的3′LTR，在载体逆转录时成为5′LTR，因其缺乏HIV1增强子及启动子序列，即使存在所有的病毒蛋白也不能转录出RNA，因此该载体系统更加安全。第3代慢病毒载体系统将可诱导性基因插入慢病毒载体，可以人为地控制转移基因的表达，又可保留自身失活的特性。第3代慢病毒载体又称可调控性慢病毒载体[11]。目前可以使HIV载体颗粒保持高度稳定性，并使其能够通过超速离心而浓缩，达到高滴度，使滴度提高。
5 慢病毒载体法制备转基因动物
1996年开始，对慢病毒的研究一直用于细胞转染和基因治疗，直到PfeiferA等[12]用慢病毒感染的胚胎干细胞注入小鼠的桑椹胚，外源基因在桑椹胚和子代小鼠中稳定高效表达。LoisC等[13]进行了转基因大鼠和小鼠的研究，在绿色荧光蛋白基因后面加上旱獭肝炎病毒转录后调控元件(WRE)，以提高GFP基因的转录水平。通过注射10 pL～100pL携带绿色荧光基因的慢病毒浓缩液到小鼠受精卵的卵黄间隙中(透明带下注射)，培养72h后可以看到发育到桑椹期或囊胚期的胚胎的荧光表达，移植到代孕小鼠体内，出生的17只小鼠中有14只(82%)至少携带一个拷贝基因，13只小鼠(76%)的爪和尾上可以看到荧光表达，在后续的试验中，Lois等将效率提高到了87.5%和80%。同时进行了大鼠的慢病毒转基因研究，59.1%感染后胚胎携带外源基因，40.9%出生小鼠表达荧光，并且在F1代也有荧光表达，说明慢病毒载体法可以用于性腺遗传。Lois等的研究，揭开了慢病毒载体法制备转基因动物的序幕，在其后有多个实验室投入到这项研究中。
随着慢病毒载体法在转基因小鼠和大鼠上的研究成功， 随后也进行了猪、牛等大动物的转基因研究。Wolfgang MJ[15]用慢病毒感染植入猴子胚胎，没有成功制备转基因猴。但HofmannA等[16]利用慢病毒载体法首次成功制备绿色荧光蛋白转基因猪。在未卵裂受精卵的透明带下注射携带LVPGK(一种通用启动子)的慢病毒载体，在获得的46头转基因猪中，36头(76%)携带外源基因，其中30头(94%)表达荧光，经直接荧光显影和免疫组化检测，在转基因猪的所有组织均表达GFP，包括生殖细胞；试验还证实了外源基因能通过性腺遗传给后代。为了进一步对大动物进行转基因研究，HofmannA等[17]对牛进行了慢病毒研究，将慢病毒注射到牛受精卵的卵间隙中，结果移植后出生的牛犊并没有携带外源基因。Hofmann等用慢病毒(LVGFP)对48枚卵母细胞进行了透明带下注射，随后体外受精，7d后有12枚发育到囊胚，荧光检测10枚有荧光，移植了其中的8枚到4头代孕母牛，4头怀孕，产下的4只牛犊，均稳定表达荧光(100%表达)，由于卵母细胞不完整的核膜结构，更有利于前病毒的整合，从而显著提高转基因效率。他们还用慢病毒感染了牛胚胎成纤维细胞，进行了核移植，产下了1头转基因克隆牛，也有稳定的外源基因表达。MichaelC等[18]使用慢病毒载体法制备转基因山羊，GFP基因携带短发卡结构RNA(shRNAs)，生产出的转基因山羊表达荧光，在RNA干扰下，抑制朊病毒蛋白质的表达，将慢病毒载体法进行了延伸。RyuBY等[19]研究慢病毒载体感染精原干细胞(SSCS)，注射到大鼠睾丸中，可以大规模生产转基因动物，这种方法同样拓宽了慢病毒载体法的思路。
McGrew MJ等[20]对慢病毒载体法制备转基因禽类和鸟类进行了研究，并利用该方法高效制备了转基因鸡，效率比以往其他方法高出数百倍；Scott BB等[21]用慢病毒携带人突触蛋白Ⅰ基因启动子，通过油压注射系统注射到鹌鹑胚盘下腔(3μL/枚)，然后孵化，出生的鹌鹑7周后与野生型交配，产生的后代经过检测，由于感染颗粒过大，不能完全感染所有胚盘细胞，获得了嵌合型转基因鹌鹑，并可以种系遗传，在外周和中枢神经都有GFP的特异性表达。饭岛信司等[22]也成功地生产了转基因鸟类。
张敬之等[23]进行了转基因小鼠的研究，43枚经卵周隙注射病毒的受精卵移植至4只假孕母鼠输卵管内，发育至12时剥出胎鼠作外源基因整合分析。在16只受检胎鼠中，经PCR检测有6只呈GFP基因阳性，阳性率为37.5%，其中4只GFP镜检呈阳性，另有138枚经病毒注射的受精卵移植于10只受体小鼠的输卵管内，产出F0代小鼠20只PCR检测有9只呈GFP基因阳性，阳性率为45%，且在各个脏器均有表达。徐世永等[24]以绿色荧光蛋白为标记基因，用慢病毒载体制作转基因鸡，PCR检测显示有67%的个体为转基因阳性， 其中2只可从活体体表直接发现较强的绿色荧光信号。绿色荧光蛋白的表达呈斑点状嵌合分布，出现在鸡冠两侧、喙、面部皮肤裸露处， 耳、前胸羽毛稀疏处， 爪及趾甲等部位。
6 展望
作为载体的慢病毒基因组约为10 kb，而调控序列约有1.5 kb，所以外源基因和启动子总基因长度不能大于8.5kb，目前限制了大片段目的基因的转基因动物生产，为了最大限度地插入基因，在很多情况下可以将基因的内含子剪切掉，但如果基因的内含子中含有调节序列，则表达效果会受到影响；目前病毒的滴度还较低，必须进一步提高慢病毒的滴度，以提高转导效率；慢病毒载体是以艾滋病病毒作为基本骨架，因此人们会担心病毒载体介导的转基因的安全性，其实人们使用慢病毒载体是基于十多年的研究经历，其安全性已得到了极大的提高，质粒在一个细胞内同时发生有序重组产生活病毒的可能性小至几乎为零。SachdevaG等[25]用HIV1和HIV2杂交或嵌合，进一步提高了载体的安全性。随着研究的深入，慢病毒载体的安全性会得到进一步的提高。
慢病毒是一种安全高效的转基因载体，目前与其他技术结合，如感染干细胞或成纤维细胞制作转基因嵌合体或转基因克隆动物。LV载体与小的干扰性RNA(siRNA)或shRNAs技术结合抑制特异基因的表达或Knockdown(敲除)，也可能成为制备抗病毒动物的有效方法。尽管慢病毒载体法还存在着基因片段长度限制，安全性需提高，可能会造成基因沉默等问题，但相信慢病毒载体法必将成为转基因工程的利器，进一步推动转基因动物研究的发展。