摘 要：为了研究国产硫酸头孢喹肟对昆明小鼠的急性毒性和蓄积毒性，采用改良寇氏法测定国产硫酸头孢喹肟的LD50；以剂量定期递增法计算蓄积系数，并于给药后第21天给予试验组和对照组小鼠1LD50的量，观察各组小鼠对硫酸头孢喹肟的耐受性。结果表明，国产硫酸头孢喹肟原料药对小鼠口服LD50大于5 000mg/kg，其混悬液制剂对小鼠腹腔注射LD50为844.03 mg/kg，LD50的95%可信限为802.05mg/kg～887.56mg/kg；蓄积试验中无小鼠死亡，蓄积系数K>5.3；耐受性试验显示，试验组死亡率(10%)显著低于对照组(40%)(P<0.05)。由此可见，国产硫酸头孢喹肟毒性低，临床使用安全，对小鼠没有蓄积毒性，小鼠对本品可产生明显耐受性。
关键词：国产硫酸头孢喹肟；急性毒性；蓄积毒性；小鼠
头孢喹肟(cefquinome)，原称HR111V，又名克百特，为动物专用的第4代头孢类抗生素，最早由德国赫斯特动物保健品公司于20世纪80年代研制，1993首次批准上市[12]。其作用机制与其他头孢类抗生素基本一致，抗菌谱广，抗菌活性强，对革兰氏阳性菌(G＋)和革兰氏阴性菌(G－)包括铜绿假单胞菌(绿脓杆菌)、厌氧菌以及产生AmpC型β内酰胺酶的肠杆菌科细菌等均有良好的抗菌活性[3]。作为第4代头孢菌素，头孢喹肟分子结构不同于前面的3代头孢菌素，它在β内酰胺结构团的C3上引进了季铵基侧链，提高了对细菌周质腔的渗透能力以及与青霉素结合蛋白的结合力，正是这种特殊的分子结构，显示了它对染色体和质粒编码的β内酰胺酶高度稳定。由于其抗菌效果好、毒性低、残留低、安全性高，已被欧盟批准主要用于敏感菌引起的牛、猪的呼吸道感染，奶牛、母猪的乳房炎，以及马驹的败血症和腐蹄病的治疗[45]。硫酸头孢喹肟是头孢喹肟的硫酸盐冻干粉，其制剂是硫酸头孢喹肟与植物油混合而成的混悬液，系南京新兽药工程技术中心研制的二类新兽药。为评价本品的安全性，提供临床合理用药依据，本文对硫酸头孢喹肟的急性毒性和蓄积毒性进行了试验研究[67]。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 药品 硫酸头孢喹肟由南京新兽药工程技术中心提供，分原料药与2.5%硫酸头孢喹肟注射液两种。原药现配现用。其制剂为硫酸头孢喹肟注射液，规格为10mL含0.25 g。
1.1.2 实验动物 清洁级昆明小鼠110只，体重18 g～22g，雌雄各半，购自南京中医药大学实验动物中心，动物生产许可证号为SYXK(苏)2006－0007，试验期间饲喂小鼠全价颗粒料，室温控制在19℃～25 ℃，相对湿度为40%～60%，人工昼夜(12 h白昼，12 h黑夜)。
1.2 方法
1.2.1 LD50测定 经过反复预试验确定LD0～LD100区间范围，并依之分组，确定组间比，正式分组试验(每组10只小鼠)，统计死亡率，以简化寇氏法计算LD50值及其95%可信限范围；用药后观察小鼠临床症状(毒性反应及药物的刺激性)，并将死亡小鼠剖检，观察其内脏等实质器官的病理变化。
1.2.1.1 口服原药组 实验动物分为3组，每组10只，按2 500、5 000、10 000mg/kg体重口服，用双蒸水将原药配成混悬液，现配现用，24 h内分3次～6次灌服。
1.2.1.2 腹腔注射硫酸头孢喹肟注射液组 在预备试验的基础上，高低浓度选取1∶0.85为剂量比，用灭菌的生理盐水按等容量稀释法[8]配制成5组不同浓度的药物，最低剂量组为600mg/kg，最高剂量组为1 149.41 mg/kg，按0.25 mL/10g分别一次性腹腔注射5组不同剂量的硫酸头孢喹肟混悬注射液。
1.2.2 蓄积毒性试验 选择体重在15 g～18g的小鼠60只，随机分为40只为蓄积毒性试验组，20只为对照组，各组小鼠雌雄均各半。采用剂量递增连续染毒法来评价硫酸头孢喹肟的蓄积毒性(表1)。每天按体重一次性腹腔注射给药，每只小鼠的给药体积均为0.25mL/10 g。试验期间，观察小鼠的一般表现并按时称重，记录小鼠死亡的情况并计算蓄积系数。
表1 硫酸头孢喹肟的染毒方案
Table 1 The doses of cefquinome sulfate given to mice on day 1～20days
染毒时间/d Exposure time | 1～4 | 5～8 | 9～12 | 13～16 | 17～20 |
每日染毒剂量/LD50 Exposure daily dose | 0.1 | 0.15 | 0.22 | 0.34 | 0.50 |
每日染毒剂量/(mg·kg－1) Exposure daily dose | 84.40 | 126.60 | 185.69 | 286.97 | 422.02 |
4 d累计剂量/LD50 Accumulated dose for 4 days | 0.4 | 0.6 | 0.9 | 1.36 | 2.00 |
累积总剂量/LD50 Accumulated total dose | 0.4 | 1.0 | 1.9 | 3.26 | 5.26 |
累积总剂量/(mg·kg－1) Accumulated total dose | 33.76 | 844.03 | 1 603.66 | 2 751.54 | 4 439.597 8 |
1.2.4 数据处理 试验结果用SPSS for windows11.0软件包进行统计，耐受性试验中的死亡率用卡方检验，小鼠体重的变化采用t检验，进行差异显著性分析。
2 结果
2.1 LD50测定
2.1.1 口服原药试验 结果显示，只有10 000mg/kg组于给药第2天死亡3只，经剖检发现其胃内胀满药物，静脉血管怒张，肺气肿，其余消化道及实质器官未见肉眼可见变化。因此，原药LD100值应大于5000 mg/kg(即大于5 g/kg)，其LD50值大于5 g/kg，按毒性分级标准应属于实际无毒。
2.1.2 腹腔注射硫酸喹肟注射液试验 硫酸头孢喹肟混悬注射液注射后高剂量组小鼠精神沉郁，倦缩，趴卧不好动，10min后中毒较重者小鼠逐渐烦躁不安，震颤，呼吸急促，个别小鼠呈轻度兴奋状态，大多数在30min内死亡，其他小鼠死亡时间大多集中在给药后0.5 h～1.5h内，临死前小鼠均剧烈挣扎、乱窜，随后全身震颤，抽搐，皮肤黏膜发绀，呼吸困难，不久死亡。2 d～3d后未死者，异常症状很快消除，精神状态﹑饮食均恢复正常。对死亡小鼠做尸体剖检，肉眼观察可见右心房与右心室明显淤血；其余组织器官无明显肉眼可见的病变。其LD50计算结果见表2。
采用改良的寇氏法进行计算，得LD50＝844.03 mg/kg，LD50的95%可信限为802.05 mg/kg～887.56mg/kg。
表2 腹腔注射硫酸头孢喹肟的急性毒性试验小鼠死亡率统计表
Table 2 The mortality of acute toxic mice given cefquinome sulfateintraperitoneally
组别 Groups | 动物数/只 Animal number | 剂量/(mg·kg－1) Dose | 剂量对数 Dose log | 死亡数/只 Death number | 死亡率/% Mortaliy |
1 | 10 | 1 149.41 | 3.060 5 | 10 | 100 |
2 | 10 | 976.99 | 2.989 9 | 8 | 80 |
3 | 10 | 830.45 | 2.919 3 | 5 | 50 |
4 | 10 | 705.88 | 2.848 7 | 2 | 20 |
5 | 10 | 600.00 | 2.778 2 | 0 | 0 |
整个试验期间试验组小鼠未发现有明显的毒性反应，无小鼠死亡，蓄积系数K＞5.3，说明国产硫酸头孢喹肟对小鼠没有蓄积性。试验组小鼠体重与对照组相比差异不显著(P>0.05)，见表3。
表3 硫酸头孢喹肟蓄积毒性试验小鼠的体重变化
Table 3 The weight changes of mice in the cu mulative toxicity testof cefquinome
组别 Groups | 体重变化 Weight changes | |||||
0 d | 4 d | 8 d | 12 d | 16 d | 20 d | |
雄性试验组 Male test group | 19.01±1.29 | 23.34±2.10 | 24.45±3.01 | 25.18±3.01 | 25.91±2.62 | 26.93±2.20 |
雌性试验组 Female test group | 19.21±0.87 | 22.20±1.28 | 22.68±1.94 | 23.88±2.96 | 24.01±3.43 | 25.03±2.45 |
雄性对照组 Male control group | 19.64±1.07 | 23.99±1.60 | 24.81±2.81 | 25.16±3.75 | 26.12±2.19 | 26.21±2.12 |
雌性对照组 Female control group | 18.56±1.01 | 22.18±1.68 | 22.53±3.70 | 23.41±2.13 | 23.32±1.21 | 23.34±2.26 |
蓄积毒性试验结束后，从试验组和对照组各随机选取10只小鼠分别给予一次剂量为LD50的冲击量，观察并比较小鼠的死亡或存活情况(表4)。
表4 硫酸头孢喹肟对小鼠的耐受性试验
Table 4 The tolerance test of cefquinome sulfate in mice
处理 Treatments | 给药剂量 Dosage | 死亡率/% Mortaliy | 存活率/% Livability |
对照组 Control group | 1 LD50 | 40a | 60b |
试验组 Test group | 1 LD50 | 10b | 90a |
Note：Column data marked with different superscripts meansignificant difference(P<0.05).
3 讨论
LD50是反映被检物质急性毒性较好的指标，其敏感度高，稳定性好。本试验所采用的改良寇氏法是由顾汉颐[9]在1958年提出的，此方法计算简便，但是必须有0%和100%的死亡率，是计算外源化合物半数致死量最常用的方法。据文献报道，头孢喹肟的急性毒性低，用药安全。对大鼠的静脉注射LD50为1250 mg/kg～2 000 mg/kg，皮下注射LD50为2 000mg/kg[1011]。本试验所得国产硫酸头孢喹肟原料药口服LD50大于5 000mg/kg，按外源化合物急性毒性分级标准判断为无毒物质，对小鼠腹腔注射的LD50为844.03 mg/kg，分别是临床应用剂量(猪为2mg/kg；牛为1mg/kg)的400倍～800倍，说明该药安全范围广，毒性低，使用安全。蓄积毒性是评价毒物是否容易引起慢性中毒的指标，也是我国食品安全性毒理学评价的重要检测内容之一。在本试验的蓄积毒性试验中，连续给药20d，试验小鼠未出现死亡，说明本试验所用的药物无蓄积毒性作用。经连续20d给药后，各剂量组小鼠平均增加体重与对照组相比较差异不显著(P>0.05)，说明此药对小鼠的增重效果不显著。
综上所述，硫酸头孢喹肟作为第4代头孢类抗生素，加上又是动物专用的，毒性低，安全性高，抗菌效果好，今后在市场上必有广阔的应用前景。