莱芜黑山羊胃肠道血管活性肠肽免疫反应阳性细胞的研究

摘　要：比较观察血管活性肠肽(VIP)在莱芜黑山羊胃肠道内的分布，用免疫组织化学方法显示胃肠壁各层及各肠段的分布情况。结果表明，血管活性肠肽以贲门部数量最多，结肠、空肠、幽门、盲肠、直肠、胃底次之，十二指肠、回肠、食管中未发现VIP细胞。VIP细胞形态多样，呈椭圆形和锥体形，常有突起伸至其他细胞附近，也有突起直达上皮表面。

关键词：血管活性肠肽；胃肠道；免疫组织化学；莱芜黑山羊

血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)又名舒血管肠肽，为一直链肽，分子质量为3 323ku，属胰高血糖素—胰泌素家族，在生物体内分布极广，作用也较广，它既作为胃肠道激素，又是神经肽。许多免疫活性细胞不仅能释放少量VIP，在其表面也有VIP高亲和力受体存在，有研究揭示VIP是神经系统和免疫系统之间相互作用的一种信号分子，在机体免疫，尤其是在局部黏膜免疫中起着一定的作用[1­2]。

近年来，前胃弛缓、瘤胃积食、胃肠炎、肠梗阻等胃肠道疾病不同程度地影响着养羊业的发展，甚至造成了严重的损失。研究发现，胃肠激素与多种胃肠疾患密切相关，具有潜在临床应用价值，应用前景广阔[3]。随着免疫组化、放射免疫分析、蛋白质提纯和分析、核酸原位杂交、重组DNA等技术的研究和应用，进一步证实消化管内分泌细胞的结构、分布与功能意义，胃肠内分泌细胞的研究已发展成为胃肠内分泌学[4]。

虽然胃肠道内分泌细胞的研究已比较广泛，但就反刍动物，特别是山羊的研究却较少见，国内尚属空白。本文采用免疫组织化学方法和免疫生物电镜技术，结合计算机图像分析系统，研究山羊胃肠道VIP内分泌细胞的形态结构特点及其分布，为胃肠内分泌学提供组织形态基础。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　试验用动物　山东省莱芜黑山羊育种研究所随机选出营养良好、体态匀称的莱芜黑山羊6只，年龄2周龄～3周龄之间，体重20kg～30 kg，正常饲喂。

1.1.2　试剂及试验用品　兔抗VIP多克隆抗体、抗兔SABC试剂盒、DAB染色试剂盒、多聚赖氨酸为武汉博士德生物有限公司产品，切片石蜡为天津巴斯夫化工有限公司产品。中性树胶、载玻片、盖玻片为上海玻璃器皿二厂生产。其他试剂均为国产分析纯。

1.2　方法

1.2.1　石蜡切片的制作　颈动脉放血处死山羊，剖开腹腔，充分暴露脏器，自食管向下依次分离食管、胃底、幽门、十二指肠、空肠、回肠、结肠、直肠组织，立即投入100mL/L中性福尔马林液于4 ℃固定。以固定好的组织块进行适当修整后经流水冲洗12 h～24h，然后用梯度酒精使组织块充分脱水。后经透明、浸蜡、包埋，切成厚度为5 μm的切片，在水温40 ℃～45℃下展片和贴片，然后将其置温箱中烘干。

1.2.2　免疫组织化学SABC法　取连续切片，采用免疫组织化学SABC法显示VIP阳性细胞。具体试验步骤如下：①载玻片经Poly­Lysine防脱片处理，捞片后置烤箱于58℃～60 ℃经30 min～60 min，以使切片紧密黏附。②切片常规脱蜡至水。③蒸馏水新鲜配置的30 mL/L的H2O2，室温反应5min～10 min以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。④热修复抗原。将切片浸入0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)，微波炉加热至沸腾后断电，冷却后PBS洗涤1次～2次。⑤滴加正常山羊血清封闭液(50 g/L BSA),20 ℃，20min。甩去多余液体，不洗。⑥滴加适当稀释的一抗(兔抗VIP,1∶200),4 ℃过夜。PBS(pH 7.2～7.6)洗3次(2min/次)。⑦滴加生物素化二抗(山羊抗兔IgG)，20 ℃，20 min。PBS(pH 7.2～7.6)洗3次(2min/次)。⑧滴加试剂SABC,20 ℃，20 min。PBS(pH 7.2～7.6)洗4次(5min/次)。⑨DAB显色。使用DAB显色试剂盒(AR1022)。室温显色，显微镜下控制反应时间。⑩苏木素轻度复染。脱水，透明，封片。显微镜观察。

1.2.3　对照试验　用正常兔血清代替一抗，其他步骤与试验组相同。

2　结果

VIP激素抗体在莱芜黑山羊消化道内的阳性细胞呈棕黄色，阳性部位位于胃的胃腺上皮、肠的黏膜和肠腺上皮内的内分泌细胞。VIP阳性细胞以贲门腺区分布数量最多(图1A)，结肠(图1F)、空肠(图1D)、幽门(图1B)、盲肠(图1E)、直肠(图1G)、胃底(图1C)次之，十二指肠、回肠、食管中未发现VIP细胞。VIP细胞形态多样，呈椭圆形和锥体形，常有突起伸至其他细胞附近，也有突起直达上皮表面。

A.贲门腺上皮VIP阳性细胞(1 000×)； B.幽门VIP阳性细胞(1 000×)；C.胃底腺上皮VIP阳性细胞(1000×)；D.空肠黏膜固有层VIP阳性细胞(1 000×)；E.盲肠肠腺上皮VIP阳性细胞(1 000×)；F.结肠黏膜固有层VIP阳性细胞(1 000×)；G.直肠肠腺上皮VIP阳性细胞(1 000×)

A.VIP positive cells in the epithelium of cardiac gland(1000×)；B.VIP positive cells in the pylorus(1 000×)；C.VIP positivecells in the epithelium of fundus gland(1 000×)；D.VIP positivecells in the lamina propria of jejunum(1 000×)；E.VIP positive cellsin the intestinal gland of caecum(1 000×)；F.VIP positive cells inthe lamina propria of colon(1 000×)；G.VIP positive cells in theintestinal gland of rectum(1 000×)

图1　VIP阳性细胞在胃肠道的分布及组织结构特点

Fig.1　The distribution and structural characteristics of VIPpositive cells in the gastrointestinal tract

将免疫阳性细胞在镜下出现的相对频率(200×)分为5种类型：①未检测到，用“－”表示。②仅偶尔出现(每个视野中阳性细胞不多于1个)，用“±”表示。③少量出现(每个视野中阳性细胞不多于3个)，用“＋”表示。④中等数量(每个视野中阳性细胞不多于5个)，用“＋＋”。⑤大量出现(每个视野中阳性细胞7个或多于7个)，用“＋＋＋”表示(表1)。

表1　莱芜黑山羊胃肠道血管活性肠肽的分布密度

Table 1　The distribution density of VIP cells in thegastrointestinal tract

用正常兔血清代替一抗的对照切片呈阴性反应，未见阳性细胞，说明所使用一抗是特异性的。

3　讨论

VIP是反刍动物体内分布较广和数量较多的一种激素，它对调节消化功能起着重要的作用[2]。哺乳动物消化道内VIP细胞的研究国内外并不多见，某些鱼类消化道内发现这些细胞[5]。有的学者认为哺乳动物消化道内无VIP细胞[6]。对莱芜黑山羊的试验中发现，其消化道中以贲门腺区的阳性细胞密度为最高。结肠、空肠、幽门、盲肠、直肠、胃底密度分布次之，在十二指肠、回肠、食管部未发现阳性细胞的出现。这与OlssonC等[5]的报道迥然不同。此外，张盛周等[7]认为在扬子鳄中主要分布于胃贲门部，少数见于胃体和胃幽门部，密河鳄则整个胃肠道都有大量的VIP神经分布。蜥蝎类中，四棱南蜥和金氏胎生蜥中有VIP免疫反应神经纤维和细胞体分布。竹叶青蛇VIP细胞分布与扬子鳄相似，在胃体和贲门处有少量分布，VIP细胞主要分布在固有层和肌肉食道中。VTP能引起胃容受性舒张，抑制胃酸分泌，刺激小肠分泌[8]。这可能与蛇类常整个吞食食物的习性有关，有利于食物在消化道内顺利运输。杨贵波等[9]在对中华竹鼠胃肠道内分泌细胞分布型的研究中发现，6月龄以上中华竹鼠GIEC分布的范围中未发现VIP细胞。在人的胃肠道内分泌细胞的研究中，国外有资料表明，肽能神经纤维(如VTP)广泛分布于含平滑肌的器官，尤其是含括约肌的部位。是否在这些部位，其内分泌细胞是否明显占优势？付承英等[10]证实了这种推测，含括约肌的十二指肠乳头部高于十二指肠及其他部位。