摘 要：选择未接种禽流感新城疫疫苗的黄腹角雉所产蛋，经孵化后，于10日龄选黄腹角雉15只，随机分成A、B、C3组，每组5只，以点眼接种量的10、15、20羽份，直接口腔滴入禽流感新城疫重组二联活疫苗rlH5株口服免疫。分别于接种前1d和3次接种后15d经翅静脉采血，通过测定其禽流感和新城疫血凝抑制试验(HI)抗体滴度。结果表明，第2次接种20羽份剂量抗体效价达到峰值，新城疫和禽流感HI抗体均值分别为7.5log2和5.5 log2。
关键词：黄腹角雉；禽流感新城疫重组二联活疫苗；口服免疫
禽流感(Avian influenza，AI)和新城疫(Newcastledisease，ND)为重大疫病，在家禽和野生禽类中传播快、病死率高，危害严重[1]。同时禽流感病毒会感染人类，威胁到人类的健康和安全。目前禽流感免疫方法主要通过肌肉注射禽流感灭活疫苗，这对于家禽和笼养的野生禽类是可行的[23]。但对于活动空间较大的放养的野生鸟类，实行肌肉注射免疫接种难度较大。另外，诱捕后肌肉注射接种可导致动物产生应激反应，引起动物机体抵抗力下降，导致疾病的发生，甚至出现死亡。新城疫的预防已有成功的疫苗和免疫程序[45]，但禽流感新城疫重组二联活疫苗(rlH5株)的口服免疫还未见报道。
中国农业科学院哈尔滨兽医研究所哈尔滨维科生物技术开发公司生产的“禽流感新城疫重组二联活疫苗(rlH5株)”可使高致病禽流感和新城疫的免疫一次完成，收到一种疫苗预防两种重大疫病的效果[67]。本试验应用该疫苗免疫国家一级保护动物黄腹角雉[89]，通过增加免疫剂量，多次重复口服免疫，为禽流感新城疫免疫工作提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验用动物 10日龄的黄腹角雉为湖南野生动物救护繁殖中心雉类饲养场未接种禽流感新城疫疫苗的黄腹角雉所产蛋孵化出的雏鸟。
1.1.2 疫苗与试剂禽流感新城疫重组二联活疫苗(rlH5株)和禽流感H5亚型HI抗原，批号20070001，由哈尔滨维科生物技术开发公司提供；10mL/L鸡红细胞悬浮液，采集健康青年鸡血自制；9g/L灭菌生理盐水，湖南科伦制药有限公司生产，批号20070425；新城疫低毒力活疫苗(Ⅱ系)由湖南亚华种业股份有限公司生产，批号20060115。
1.2 方法
1.2.1 新城疫HI抗原的制备 取9日龄鸡胚3枚，绒毛尿囊腔接种新城疫低毒力活疫苗(Ⅱ系)0.2 mL，选接种24 h～36h死亡的鸡胚，立即置4 ℃冰箱4 h，分别收获鸡胚尿囊液，装于灭菌试管中，加入1 mL/L甲醛灭活，置4 ℃冰箱备用。
1.2.2 黄腹角雉的接种 将试验用黄腹角雉分为A、B、C3组，每组5只，待其适应环境后，将禽流感新城疫重组二联活疫苗(rlH5株)用无菌生理盐水溶解，以点眼量的10、15、20羽份直接口腔滴入。接种3次，每次接种间隔15d。分别于接种前15 d和3次接种后15 d经翅静脉采血，每次1 mL～1.5 mL。静置1 h～2 h待血液凝固后，收集血清置于56℃水浴锅中灭能30 min，置－20 ℃保存备用。
1.2.3 10 mL/L鸡红细胞的制备 采取抗凝血，于2 000 r/min离心 10min，弃上清液。将红细胞洗涤3次，最后用灭菌生理盐水配成10 mL/L悬液。鸡红细胞质脆易碎，必须新鲜配制，4 ℃冰箱内保存不超过2 d，使用时充分轻轻混匀。
1.2.4 血凝(HA)试验 HA试验按常规方法操作，测定购买的AIV H5亚型HI抗原和自制的NDV HI抗原的血凝效价[10]。
1.2.5 血凝抑制(HI)试验 利用HA测定的8个单位血凝价的AIV H5亚型HI抗原和自制的NDVHI抗原检测样本血清的AIV和NDV的抗体滴度[10]。 黄腹角雉免疫前ND和AI抗体水平见表1。
2 结果
黄腹角雉免疫后ND抗体水平和免疫后AI抗体水平见表2。
表1 黄腹角雉接种疫苗前ND和AI抗体水平
Table 1 ND antibody titers of Tragopan caboti before vaccination
项目 Items | 测定数 Checked number | 抗体分布Antibody distribution | HI均值/log2 Average value | |||||||
20 | 21 | 22 | 23 | 24 | 25 | 26 | 27 | |||
新城疫 ND | 6 | 1 | 1 | 4 | 1.5 | |||||
禽流感 AI | 6 | 1 | 3 | 2 | 1.17 |
Table 2 ND antibody titers of Tragopan caboti after vaccination
目 Items | 组别 Groups | 接种剂量 Inoculation dose | 第1次接种后HI均值/log2 Average HI value after first inoculation | 第2次接种后HI均值/log2 Average HI value after second inoculation | 第3次接种后HI均值/log2 Average HI value after third inoculation |
新城疫 ND | A组 | 10羽份 | 5.0 | 5.0 | 5.0 |
B组 | 15羽份 | 6.0 | 6.5 | 5.5 | |
C组 | 20羽份 | 7.0 | 7.5 | 6.0 | |
禽流感 A I | A组 | 10羽份 | 2.0 | 3.5 | 3.5 |
B组 | 15羽份 | 2.5 | 3.5 | 4.0 | |
C组 | 20羽份 | 3.0 | 5.5 | 5.0 |
本试验采用禽流感新城疫重组二联活疫苗(rlH5株)口服免疫雉鸡，检测了接种疫苗前后AIV和NDV抗体的水平。结果显示，接种后抗体水平均开始上升，第2次接种后抗体效价达到高峰，10、15、20羽份接种剂量新城疫HI抗体水平分别上升了3.5、5.0、6.0个滴度，10、15、20羽份禽流感HI抗体水平分别上升了2.33、2.33、4.33个滴度。表明黄腹角雉口服接种禽流感新城疫重组二联活疫苗rlH5株能产生较高的抗体效价。20羽份接种剂量的抗体效价最高，故可作为黄腹角雉接种禽流感新城疫二联苗的推荐剂量，也可应用于其他野生雉类。
三种不同剂量的禽流感新城疫重组二联活疫苗(rlH5株)口服，第2次20羽份接种剂量的血清抗体水平最高。所以，在一定剂量范围内，疫苗剂量越大，抗体滴度上升越快，抗体水平越高。另外，口服接种方法简单、安全，避免了注射疫苗所需要的严格标准；节省劳力，避免诱捕动物引起应激反应而造成损失。