摘 要：针对安徽省部分地区猪伪狂犬病发病率较高，给全省的养猪业造成较大危害的状况，应用聚合酶链反应(PCR)对安徽省7个地区21个养猪场的187头疑似发病猪的血清进行伪狂犬病病毒(PRV)的检测，并对阳性猪的流行病学分布情况进行统计分析。结果显示，安徽省猪PRV平均阳性率为34.2%；其中安徽省南部地区PRV阳性率最高，北部地区最低，规模养殖场PRV阳性率明显低于散养户，其结果为安徽省猪伪狂犬病流行病学调查及防控提供参考资料。
关键词：猪伪狂犬病；聚合酶链反应；流行病学调查
伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)引起的多种家畜和野生动物以发热、奇痒(猪除外)及脑脊髓炎为主要症状的一种重要传染病[1]。本病尤以猪的发病比较多见，成为重要的病毒贮存宿主和传染源。近年来，随着养猪业的蓬勃发展，安徽省部分地区猪伪狂犬病发生的频率和危害程度有所上升，发病率最高达95%，病死率5%～30%不等，给安徽省养猪业带来巨大的经济损失。伪狂犬病病毒属于双股DNA病毒，为疱疹病毒群成员，具有疱疹病毒科病毒的共同特性，即动物一旦被其感染，病毒可在动物体内呈长期潜伏感染状态，可在体内存活数年甚至终生，且难以清除。有时，在受到体内或外界因素的刺激后病毒还可被重新激活而排毒传播。因此，及时而准确检测PRV，对于预防、治疗及根除猪伪狂犬病意义重大[2]。PRV病原学常规检测方法常常存在特异性低、敏感性差、操作技术复杂、费时费力等缺点。聚合酶链反应(PCR)是特定DNA片段体外扩增的新技术[3]，具有快速、特异、敏感的特点，已广泛用于许多病毒和细菌病的快速诊断[46]。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 血清 采集疫区疑似发病猪的血清。其中宣城市2县区发病猪血清49份，芜湖市繁昌县发病猪血清23份，马鞍山市1县区发病猪血清13份，巢湖市2县区发病猪血清35份，合肥市区发病猪血清14份，滁州市2县区发病猪血清33份，蚌埠市五河县发病猪血清20份，共187份猪血清。
1.1.2 试剂 猪伪狂犬病毒PCR诊断试剂盒为北京世纪元亨公司生产，批号为PRV2006002。
1.2 方法
1.2.1 全血样品处理 取血清样品各100 mL，加入500 μL消化液和10 μL蛋白酶K，混匀后，置55 ℃水浴中过夜。
1.2.2 病毒模板DNA的提取 从水浴锅中取出已处理的样品，加600 μL酚/氯仿/异戊醇混合液混匀，12 000r/min离心10 min。500 μL上清置于灭菌离心管中，加入500 μL异丙醇，混匀，置－70 ℃冰箱中30min。然后取出，室温融化，13 000 r/min离心15 min。弃上清，滴入1 mL浓度为750mL/L的乙醇，将离心管倒扣于吸水纸上1 min，再将离心管50 ℃烘干或真空抽干15 min。取出样品管，用30μL灭菌去离子水溶解沉淀，作为模板备用。
1.2.3 PCR扩增 取16 μL PCR反应液(用前混匀),2 μL Taq NA聚合酶(0.5 U/μL),2μL模板DNA，总反应体积20 μL，混匀，加入矿物油20 μL覆盖。扩增条件为：94 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s,65 ℃30 s,72 ℃ 30 s，循环35次；72 ℃ 7 min。
1.2.4 电泳 称4 g琼脂糖放于500 mL锥形瓶中，加入50倍稀释的TAE电泳缓冲液200 mL溶解，并加入20μL溴化乙锭溶液混匀，电泳并拍照。
2 结果
2.1 PCR扩增结果
由图1可知，应用猪伪狂犬病毒诊断试剂盒，从芜湖市繁昌县7份发病猪血清扩增出2个特异性带(第3、4泳道)，长度为217bp，与阳性对照扩增带一致。
由图2可看出，从巢湖市2县区的11份发病猪血清中扩增出5个长度为217bp的特异性带(第5、7、9、12、13)，未出现扩增带的为阴性结果。
1～7.样品；8.阳性对照；M.DNA标准DL 2 000
17. Samples；8.Positive control；M.DNA Maker DL 2 000
图1 芜湖市繁昌县PRV PCR产物电泳图
Fig.1 Electrophoresis of PRV PCR products in fanchang county，Wuhucity
1.阴性对照；2.阳性对照；3～13.样品；M.DNA标准DL 2 000
1.Negative control；2.Positive control；313.Samples；M.DNA Maker DL 2000
图2 巢湖市2县区PRV PCR电泳图
Fig.2 Electrophoresis of PRV PCR products in two counties of Chaohucity
2.2 安徽省部分地区PR流行病学调查结果
运用PCR技术对安徽省7个地区21个养猪场的187头疑似发病猪的187份血清进行PRV病原检测(表2)。从表2可以看出，7个地区所采猪血清经PCR检测，发现6个地区为PRV阳性，在187份疑似病料中，检出PRV阳性64份，检出率高达34.2%，其中马鞍山市阳性率最高为100%，合肥市未检出。
表2 猪伪狂犬病病毒的检测结果
Table 2 Detection results of PRV
样本来源 The origin of samples | 饲养方式 Breeding style | 血清数/份 Seral number | PRV阳性数/份 Positive number | 阳性率/% Postive rate |
宣城市 Xuancheng city | 散养 Scattered | 49 | 24 | 49.0 |
芜湖市 Wuhu city | 规模 Large scaled | 23 | 2 | 8.7 |
马鞍山市 Ma’anshan city | 散养 Scattered | 13 | 13 | 100 |
巢湖市 Chaohu city | 规模 Large scaled | 35 | 7 | 20.0 |
合肥市 Hefei city | 规模 Large scaled | 14 | 0 | 0 |
滁州市 Chuzhou city | 散养 Scattered | 33 | 16 | 48.5 |
蚌埠市 Benbu city | 散养 Scattered | 20 | 2 | 10.0 |
总计及平均阳性率 The total and average postive rate | 187 | 64 | 34.2 |
2.3 不同地区PRV阳性率的对比
安徽省南部的宣城地区共49份病料，PRV阳性率为49.0%(24/49)；安徽省中部的芜湖市、马鞍山市、巢湖市和合肥市85份病料，PRV阳性率为25.9%(22/85)；安徽省东部的滁州地区共33份病
料，PRV阳性率为48.5%(16/33)；安徽省北部的蚌埠地区共20份病料，PRV阳性率为10.0%(2/20)。
对不同地区的PRV阳性率进行比较，安徽省南部的检出率最高，东部地区次之，中部地区第三，北部地区最低(图3)。
图3 安徽省不同地区PRV的阳性率对比图
Fig.3 The comparison of PRV positive rate in different parts ofAnhui province
2.4 不同养殖方式PRV阳性率的对比
对规模猪场和散养户的检测结果进行统计，采集自散养户的病料共115份，PRV阳性54份，阳性率47.8%；采集自规模猪场的病料共72份，PRV阳性9份，阳性率12.5%。对不同养殖方式的PRV阳性率进行比较，规模猪场PRV阳性率明显低于散养户(图4)。
图4 不同养殖方式的PRV阳性率对比图
Fig.4 The comparison of PRV positive rate in different breedingstyles
3 讨论
3.1 伪狂犬病的PCR诊断
伪狂犬病的实验室诊断方法很多，常用的方法如病毒分离鉴定、琼脂扩散试验、ELISA诊断试剂盒等，而这些方法存在程序复杂，周期较长，特异性低等缺点，在发生急性动物疫情或混合感染、隐性感染时，往往不能获得满意的效果。本试验采用PCR诊
断技术，对采集的猪伪狂犬病病料进行检测，表明其具有快速、敏感、特异、稳定等特点。该技术尤其对微量的样品或难以用组织培养的方法获得多量病毒样品的检测具有一定的优势[78]。
3.2 伪狂犬病的流行病学调查
本试验检测血清187份，PRV阳性64份，平均阳性率为34.2%。调查证实PRV感染在安徽省部分地区确实存在，且感染程度较严重，急需制定有效措施进行防控。检测的7个地区中有6个地区PRV感染为阳性，其中南部PRV检出率最高，东部地区次之，中部地区第三，北部地区最低，这可能与南部地区以山地丘陵为主的地理位置及亚热带湿润季风气候环境利于PRV的传播有关，但PRV感染是否与地域有直接的关系，还有待进一步研究。安徽省不同养殖方式PRV阳性率的对比结果表明，规模猪场PRV阳性率明显低于散养户，这可能与散养猪场不能有效监控PRV的传播，造成隐性感染猪和带毒猪长期共存而互相感染，缺乏有效的隔离检疫制度，而良好的饲养管理水平有减少猪伪狂犬病感染的可能[910]。