摘 要：用兰州乳房炎检测试剂(Lanzhou mastitistest，LMT)对克拉玛依规模化奶牛场进行了奶牛隐性乳房炎流行病学调查。结果显示，该地区奶牛隐性乳房炎的发病率为70.43%(543/771)。对543份阳性牛乳样品进行了病原菌的分离鉴定，结果发现，阳性乳样品中细菌分离率达89.13%(484/543)，葡萄球菌、链球菌、肠杆菌和棒状杆菌为主要致病菌，且多为几种致病菌的混合感染。
关键词：隐性乳房炎；致病菌；分离鉴定；奶牛
奶牛乳房炎是奶牛生产中最常见的四大疾病之一，给奶牛业造成巨大的经济损失[12]。牛奶制品中携带的病原菌也会给人类的健康构成威胁[34]。虽然国内外的学者都在积极寻找有效措施来控制奶牛乳房炎，但成效不大，尤其是奶牛隐性乳房炎(又称亚临床乳房炎)病因复杂，隐蔽性强，更是一个亟待解决的难题。据报道，美国、日本的奶牛隐性乳房炎发病率为62.1%[5]，而我国为50%～80%，并呈上升趋势[68]。由此可见，我国奶牛隐性乳房炎的感染率高于世界发达国家的平均水平。奶牛乳房炎是一种多病因性疾病，分为三种疾病决定子，即病原、环境以及宿主。为了预防奶牛乳房炎，已经采用了许多较为先进的模型，例如五要点计划，使隐性乳房炎显著减少[9]。新疆克拉玛依地区规模化奶牛场规模较大，设施较为先进。对场内发生的显性乳房炎曾采用不同方法治疗，但因一些耐药菌株的出现，未能达到令人满意的效果。由于缺乏奶牛隐形乳房炎以及优势致病菌种类的资料，给防控带来了困难。该文在奶牛隐性乳房炎流行病学调查基础上，分析该地区优势致病菌的种类，以寻求最佳的控制途径。
1 材料与方法
1.1 试验用动物
被检泌乳期奶牛771头，来自新疆克拉玛依地区规模化奶牛场所属3个奶牛养殖基地。
致病性试验动物为昆明系小鼠，雌雄对半，体重20 g～22 g，由新疆医科大学实验动物中心提供。
1.2 仪器、试剂及培养基
兰州奶牛乳房炎检测试剂(LMT)，批号20050325，购自中国农科院畜牧与兽医研究所药厂。
生化鉴定用微量发酵管，购自杭州天和微生物试剂有限公司。葡萄球菌生化微量鉴定管(凝固酶、硝酸盐还原、麦芽糖、蕈糖、甘露糖、木糖、蔗糖、核糖、乳糖、果糖、甘露醇、木糖醇、尿素酶)，批号20051028；链球菌生化鉴定管(血清菊糖、甘露醇、乳糖、棉子糖、葡萄糖、水杨素、蕈糖、淀粉、明胶、七叶苷、65g/L高盐肉汤、美蓝牛奶、马尿酸盐、pH9.6肉汤、CAMP)，批号20051020；肠杆菌生化微量鉴定管(分解葡萄糖产气、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、靛基质、甲基红、枸椽酸盐、硫化氢、尿素、运动力)，批号20050618。50mL/L绵羊鲜血琼脂培养基、麦康凯琼脂、普通琼脂、营养肉汤、血清肉汤、沙堡弱氏葡萄糖等生化培养基及试剂按常规方法配制[10]。
其他常规实验室器材由新疆农业大学兽医病理研究室提供。
1.3 隐性乳房炎的检测及乳样采集
用温水清洗乳房，2 mL/L新洁尔灭消毒乳房，用750mL/L的酒精溶液消毒乳头，带灭菌手套进行人工挤乳，弃去前三把乳汁[11]，分别将4个乳区2mL左右的乳汁挤入相应的乳汁检验盘中，倾斜加入1∶3稀释的LMT试剂2 mL，水平晃动，使乳汁与检测试剂充分混合，10s后观察，并判定结果。阴性(0～20万个体细胞数)混合物呈液状，盘底无沉淀物；可疑(15万～50万个体细胞数)混合物呈液状，少量絮状物，摇动后消失；弱阳性(40万～100万个体细胞数)有明显絮状物或沉淀产生；阳性(80万～400万个体细胞数)絮状物或沉淀黏稠不易流动；强阳性(350万个以上体细胞数)混合物几乎完全形成胶状不能流动。
选取LMT检测阳性牛，以无菌操作采集每个乳头的奶样品10mL，置无菌小玻璃瓶中加盖，标明牛号、乳室、日期，送检。经LMT普查、筛选，共采集隐性乳房炎阳性乳样品543份，供实验室细菌分离与鉴定。
1.4 乳样品的细菌分离
以无菌操作将每份乳样品分成3小份，分别做真菌、需氧菌和厌氧菌的分离培养。
1.4.1 真菌的分离培养 将一小份乳样品直接接种于含有青、链霉素的沙堡弱氏葡萄糖斜面培养基上，置37℃温箱中培养，每天观察1次，连续3周无菌落生长者可判为阴性，如长出菌落，需逐日观察菌落形态及颜色变化，以确定是否为真菌。
1.4.2 需氧菌及厌氧菌的分离培养 将其余2小份乳样品初次培养分别接种于血清肉汤，置恒温箱和厌氧罐中，37 ℃ 增菌培养16h～24 h后，观察细菌在肉汤中的生长情况，进行初步的涂片、染色、镜检，并做好记录。将初次厌氧培养物再划线接种于50mL/L绵羊鲜血琼脂培养基上，置于厌氧罐中培养24 h～48 h；初次培养的需氧培养物用无菌小棉签或接种环分别接种于50mL/L绵羊鲜血琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基和普通琼脂培养基，并做好标记，置于恒温箱培养16 h～24h，挑选单菌落做纯化培养，并涂片进行革兰氏染色，镜检[11]。
1.5 细菌鉴定
根据细菌培养特性、染色形态特征，将分离到的细菌初步分为G＋ 球菌、G－球菌、G＋ 杆菌、G－杆菌四类，确定其生化反应和其他鉴定项目。
1.5.1 G＋球菌 接触酶试验阳性者，应用葡萄球菌生化微量鉴定管进行鉴定，接触酶试验阴性者，做链球菌生化鉴定[12]。
1.5.2 G－杆菌 乳糖试验阳性者，应用肠杆菌生化微量鉴定管进行鉴定。乳糖试验阴性者，可根据菌落生长情况和MR试验阴性者确定为绿脓杆菌，阳性者可能为变形杆菌，归于肠杆菌[13]。
1.5.3 G＋杆菌 镜检观察，菌体分支的可初步定性为诺卡氏菌属，菌体不分支的为棒状杆菌[10,14]，并可进一步做接触酶等生化试验给予定性。
1.5.4 G－球菌 经革兰氏染色、镜检表明，本次试验无G－球菌。
1.6 动物致病性试验
取纯化菌株培养24 h的血清肉汤培养物以0.5mL/只的剂量，给健康小鼠腹腔注射，每个菌株为1组，每组接种10只小鼠，并设对照组接种等量血清肉汤，观察2d，记录小鼠活动及死亡情况，剖检患病或死亡小鼠，观察病变，并挑取有病变的内脏器官直接涂片镜检。
2 结果
2.1 流行病学调查结果
在被检的771头无临床症状的泌乳牛中，检出患有隐性乳房炎的牛为543头，占总数的70.43%，各分场乳样品阳性检出率见表1。
表1 各奶牛分场乳房炎阳性检出率
Table 1 Detecting rate of the mastitis in each branch dairy farm
场别 Branch dairy farm | 一分场 Farm 1 | 二分场 Farm 2 | 三分场 Farm 3 | 总数 Total |
被检乳区数/头 Number of detected cows | 189 | 256 | 326 | 771 |
LMT阳性乳区数/头 Number of LMT positive cows | 115 | 182 | 246 | 543 |
阳性率/% Positive rate | 60.85 | 71.09 | 75.46 | 70.43 |
LMT强阳性乳区数/头 Number of strongly positive cows | 10 | 22 | 34 | 66 |
强阳性率/% Strongly positiverate | 5.29 | 8.59 | 10.43 | 8.56 |
通过细菌分离试验，并结合显微镜下检查发现，所采集的543份阳性乳样品中分离出葡萄球菌、链球菌和杆菌类等，混合感染占89.13%(484/543)，见表2。进一步分离鉴定，共分离到葡萄球菌、链球菌、肠杆菌和棒状杆菌4类86株细菌，其中葡萄球菌有37株，占43.02%，链球菌有33株，占38.36%，肠杆菌类11株，占12.79%，棒状杆菌4株，占4.96%，其他杆菌1株，真菌和厌氧菌培养皿中未检出。生化鉴定结果见表3。
表2 病原菌混合感染情况
Table 2 Mixed infection of pathogenic bacteria
乳样/个 Sample | 比例/% Rate | |
单独感染 Solo infection numbers | 59 | 10.87 |
混合感染 Mixed infection number | 484 | 89.13 |
合计 Total | 543 | 100 |
表3 奶牛隐性乳房炎病原菌分离鉴定结果
Table 3 The isolation and identification results of pathogenicbacteria from subclinical mastitis
病原菌种类 Type of pathogenic bacteria | 病原菌名称 Pathogenic bacteria | 总株数 Number of strains | 所占比例/% Rate in total | 种属比例/% Rate in genus |
葡萄球菌 Staphylococci | 金黄色葡萄球菌 S.aureus | 25 | 29.07 | 43.02 |
表皮葡萄球菌 S.epidermidis | 7 | 8.14 | ||
腐生葡萄球菌 S.saprophyticus | 5 | 5.81 | ||
链球菌 Streptococci | 无乳链球菌 S.agalactiae | 17 | 19.77 | 38.36 |
乳房链球菌 S.uberis | 5 | 5.81 | ||
乳链球菌 S.lactis | 4 | 4.65 | ||
粪链球菌 S.faecalis | 3 | 3.49 | ||
牛链球菌 S.bovis | 2 | 2.32 | ||
停乳链球菌 S.dysgalactiae | 2 | 2.32 | ||
肠杆菌 Entericbacilli | 大肠埃希菌 E.coli | 3 | 3.49 | 12.79 |
沙门菌 Salmonella | 3 | 3.49 | ||
枸橼酸杆菌 Citrobacter | 2 | 2.32 | ||
福氏志贺杆菌 Shigellaflexneri | 2 | 2.32 | ||
克雷伯菌 Klebsiella | 1 | 1.17 | ||
棒状杆菌 Corynebacteria | 化脓棒状杆菌 Corynebacteriumpyogenes | 3 | 3.49 | 4.96 |
牛棒状杆菌 C.bovis | 1 | 1.17 | ||
其他 Others | 其他G＋杆菌 Other G＋bacillus | 1 | 1.17 | 1.17 |
总计 Total | 86 | 100 | 100 |
2.3 动物致病性试验结果
用分离得到的16种细菌的肉汤培养物腹腔接种小鼠后观察发现，24h内这16种细菌均可引起小鼠不同程度的精神沉郁，呼吸急促，食欲废绝等临床症状，并有部分试验组小鼠开始死亡(表4),48h后被接种小鼠仍有不同程度发病、死亡。剖检死亡小鼠，取其肝脏组织直接涂片镜检，均能发现接种的细菌。
表4 小鼠接种试验结果
Table 4 Inoculation test results in Musmusculus albus
病原菌种类 Type of pathogenic bacteria | 病原菌名称 Pathogenic bacteria | 接种剂量/mL Inoculated dose | 接种数量/只 Inoculated numbers | 死亡数/只 Fatality death numbers | 死亡率/% Mortality |
葡萄球菌 Staphylococci | 金黄色葡萄球菌 Staphylococcusaureus | 0.5 | 10 | 10 | 100 |
表皮葡萄球菌 S.epidermidis | 0.5 | 10 | 2 | 20 | |
腐生葡萄球菌 S.saprophyticus | 0.5 | 10 | 4 | 40 | |
链球菌 Streptococci | 无乳链球菌 S.agalactiae | 0.5 | 10 | 8 | 80 |
乳房链球菌 S.uberis | 0.5 | 10 | 2 | 20 | |
乳链球菌 B.lactis | 0.5 | 10 | 1 | 10 | |
粪链球菌 S.faecalis | 0.5 | 10 | 2 | 20 | |
牛链球菌 S.bovis | 0.5 | 10 | 0 | － | |
停乳链球菌S.dysgalactiae | 0.5 | 10 | 6 | 60 | |
肠杆菌类 Enteric bacilli | 大肠埃希菌 E.coli | 0.5 | 10 | 7 | 70 |
沙门菌 Salmonella | 0.5 | 10 | 6 | 60 | |
枸橼酸杆菌 Citrobacter | 0.5 | 10 | 2 | 20 | |
福氏志贺菌Shigellaflexneri | 0.5 | 10 | 5 | 50 | |
克雷伯菌 Klebsiella | 0.5 | 10 | 1 | 10 | |
棒状杆菌 Corynebacteria | 化脓棒状杆菌 Corynebacteriumpyogenes | 0.5 | 10 | 5 | 50 |
牛棒状杆菌 C.bovis | 0.5 | 10 | 2 | 20 | |
其他 Others | 其他G＋杆菌Other G＋bacillus | 0.5 | 10 | 1 | 10 |
对照组 Control | 0.5 | 5 | 0 | － |
3 讨论
奶牛乳房炎是乳腺受到物理、化学、微生物等因素的刺激所发生的一种炎症变化，是一种多因素疾病[15]。但是，除病原微生物外，其他因素随着奶牛饲养业的发展而逐渐改善，病原微生物就成为当前引起奶牛乳房炎的主要原因[17]。已经报道的奶牛乳房炎病原微生物有150多种，包括细菌、真菌、病毒、支原体等[6]。虽然有多种病原微生物可引起奶牛乳房炎，但研究证明，引发奶牛乳房炎的病原主要为金黄色葡萄球菌、链球菌和大肠埃希菌，由这3种病原菌引起的奶牛乳房炎约占该病发病总数的90%以上[14]。本试验结果显示，所采集的543份阳性乳样中由葡萄球菌、链球菌和杆菌类混合感染占89.13%(484/543)，单纯由某一个病原菌引起的奶牛隐性乳房炎较少，而多数是由2种～3种甚至是3种以上的病原菌引起的，由此可知，传统的治疗药物难以取得令人满意效果的原因。此外，也说明该奶牛场的卫生管理较差，使多种触染性细菌(无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄菌)和环境性细菌(乳房链球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、肠杆菌、牛棒状杆菌等)交互作用，用药时就可产生抑制此种细菌的生长却助长彼种细菌的现象。金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌菌株能侵入乳腺上皮细胞，这也是奶牛乳房炎反复发作的原因之一[18]。在金黄色葡萄球菌感染12h内，血清中的接联球蛋白和乳腺联合血清样淀粉蛋白A出现，在细菌侵入后第3天出现高峰浓度，可以用来判断奶牛隐性乳房炎发生的可能性和潜在性[19]。
建议该奶牛场加强环境卫生管理，牛舍定期消毒，清洁牛床，保持环境干燥；挤奶时正确使用挤奶器，尽量缩短挤奶时间，挤奶时用力要均匀，尽量挤净乳汁；发现异常情况及时处理，病牛及时予以治疗。加强在分娩前后，尤其是产犊初期的饲养管理。分娩前，乳房明显肿胀时，应减少多汁饲料和精料的喂量，分娩后控制饮水并适当增加运动和挤奶次数。
此外，加强干奶期奶牛的饲养管理以及奶牛乳房炎的预防及治疗也很重要，有资料显示[20]，干奶期治疗奶牛乳房炎不但能治愈现有疾病，也能预防新的感染，还有治愈率比泌乳期高、能够较长时间使用高浓度抗生素、不存在乳汁中药物残留等优点。因此，对于奶牛养殖场来说，奶牛乳房炎的预防及治疗在奶牛生产的任何时期都应是一项常抓不懈的工作。