摘 要：细胞凋亡是动物机体组织清除受损、衰老或多余细胞的一种自杀性过程，它对于保持机体各组织器官正常生长、发育、结构、功能动态平衡和维持内环境相对稳定等都具有重要意义。发生凋亡的细胞大多数是生物个体中多余或老化的细胞，有些也是发生肿瘤时的细胞或受到病毒或细菌感染的细胞。根据不同的检测方法来检测不同类型的细胞凋亡，进而来研究细胞凋亡的现象和发生机制，为揭示机体与细胞凋亡的关系和疾病与凋亡的关系提供理论依据。文章对凋亡细胞的特征、细胞凋亡各种检测方法的检测原理和结构判定，分别进行了概述。
关键词：细胞凋亡；原理；检测
细胞凋亡(apoptosis)或称程序性细胞死亡(programmed celldeath，PCD)，是指细胞本身在一定的生理或病理条件下，按照自身的程序主动性、生理性的死亡过程，它是一个多步骤，由基因调控的发生过程，涉及到一系列基因的激活、表达以及调控作用，这是个井然有序的过程，并不是病理条件下的损伤现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。早在100多年前，人们已发现细胞凋亡这种死亡形式，但是没有给其下定义。在20世纪70年代，病理学家KerrJ FR等[1]发现在大鼠肝细胞局部缺血条件下，肝细胞连续不断地转化为小的圆形的细胞质团，后来经过深思熟虑，在1972年提出并命名为细胞凋亡。随后的几十年里，对细胞凋亡的研究受到许多国家科学家的广泛重视。进入20世纪90年代，对细胞凋亡的研究更是飞速发展，获得了重大突破，受到了生物学、医学各个领域的普遍关注和重视。目前，人们对凋亡的发生机制及与疾病的关系已经有了比较全面清晰的认识，这对重新认识疾病的发生发展机制具有划时代的意义。随着对凋亡认识的不断深入，出现了一系列检测细胞凋亡的新技术和新方法。
1 凋亡细胞的特征
1.1 形态学的改变
根据形态学变化经过，可将细胞凋亡分为3个过程：①凋亡开始时，细胞表面的特化结构(如微绒毛、细胞突起及细胞表面的褶皱)消失，但细胞膜依然完整，没有失去选择通透性；线粒体大体保持完整，但是偶尔也见到线粒体变大，嵴增多；内质网囊腔膨胀扩大；细胞骨架的结构有时变得致密和紊乱；染色质浓缩分布在核膜周围或一侧，呈眼球状。②形成凋亡小体(apoptoticbody)。产生凋亡小体有两种方式，一种为发芽脱落机制，首先染色体断裂为大小不等的片断，然后通过发芽起泡，与一些细胞器聚集在一起，形成一球形的突起，形成凋亡小体。另一种为自噬体形成机制，凋亡细胞内线粒体、内质网等和一些细胞内的胞质成分一起被内质网膜包裹，再与细胞膜融合后，形成凋亡小体[2]。③凋亡小体形成后，被巨噬细胞或者邻近的细胞吞噬消化，此过程不影响其他细胞的生理功能，也不引起周围细胞的炎症反应[3]。
从细胞发生凋亡开始，到出现凋亡小体仅需数分钟，而被吞噬消化整个过程可持续4 h～9 h[4]。
1.2 生化特征
凋亡发生时线粒体呼吸链受损，使细胞生成ATP的量减少；跨膜电位降低，细胞色素C从线粒体内漏到胞质中；线粒体膜的通透性升高[5]。胞浆中Ca2＋和Mg2＋浓度升高，可以激活核酸内切酶和蛋白酶[6]。激活的核酸内切酶可以将DNA切成50bp～300 bp大小的DNA，然后进一步将染色质裂解成单个核小体和寡聚核小体，形成180 bp～200bp的DNA片断。而蛋白酶可以控制不同阶段的凋亡的发生，与此同时胞浆中pH也发生了改变。
2 凋亡细胞的检测
随着研究技术的提高和对细胞凋亡认识的不断深入，检测细胞凋亡的方法已经从细胞染色质水平发展到分子水平，检测技术也日趋成熟。一般可将检测方法分为细胞凋亡的形态学检测、生物化学变化(DNA片断)、流式细胞仪(FCM)分析、细胞凋亡酶学分析等等。
2.1 细胞凋亡的形态学检测
在凋亡形态学检测的各种方法中，其检测手段均不能很好地对凋亡细胞做定量分析，但定性分析有时由于环境因子或其他因素的影响，并非所有凋亡细胞都具有典型的凋亡形态特征[7]。可是形态学观察简便直观，并可保存标本。
2.1.1 光学显微镜下观察 ①原理。普通光镜观察可以用石蜡切片HE染色法、甲基绿派诺宁染色法、姬姆萨染色和瑞氏染色等。HE染色是根据正负电荷之间的同性排斥、异性相吸原理来进行染色的，但是如果要辨别是坏死细胞还是凋亡细胞，必须要在染色后进行分化和蓝化处理。甲基绿派诺宁染色法是根据发生凋亡时mRNA的表达增强，DNA对甲基绿染色具有特异性，RNA对派诺宁具有亲和性。姬姆萨染色和瑞氏染色也是根据染料对DNA或者RNA具有特异性建立起来的染色方法。②结果判定。HE染色可见凋亡的细胞变圆、变小、核浓染或者裂解成为大小不等的碎片和染色质染成蓝色或者蓝黑色。坏死组织呈均质红染的无结构的物质，核染色消失。甲基绿派诺宁染色在光镜下见到凋亡细胞的固缩细胞核呈现绿色或者蓝绿色着染，而坏死细胞为绿色着染。但是光镜检查难以观察细胞的超微结构变化。
2.1.2 荧光显微镜观察 ①原理。有些荧光染料对细胞DNA具有特异亲和性。但是荧光染料对活细胞、凋亡细胞和坏死细胞均显示不同的颜色，所以可以用荧光染料显示凋亡时细胞核的形态特征。且此种方法比较简单，操作性也比较强，是临床和基层检查首选的方法之一。常用的荧光染料有吖啶橙、碘化丙啶和溴化乙锭，但是检测凋亡一般用吖啶橙溴化乙锭混合染色法。②结果判定。荧光显微镜下，可见到活细胞核染色质呈现均匀分布的黄绿色荧光，胞质呈橘黄色或者橘红色荧光，出现凋亡细胞时，核染色质的黄绿色荧光浓聚在核膜内侧，凋亡细胞核的特征性形态可被清晰地辨认[8]。坏死细胞的细胞质内黄绿色或者橘黄色荧光减弱，有的甚至消失。
2.1.3 透射电镜观察 ①原理。透射电镜[9]检查细胞凋亡认为是最经典、可靠的判定细胞凋亡的方法，被认为是鉴定细胞凋亡的金标准，但是此方法对细胞凋亡只能进行定性检测而不能定量检测，这是其惟一的不足。其观察细胞凋亡的标本制作采用常规方法取材、固定、包埋和制片，与一般制片区别不大，但在取材和固定时要加以注意。②结果判定。在电镜下，可观察到凋亡细胞的超微结构出现相应的变化，表现为染色质浓缩、膜消失、内质网扩张，又可见到细胞表面的伪足形成和微绒毛消失，细胞膜呈波浪状起伏。
2.2 DNA分子水平检测
细胞发生凋亡时，DNA降解的发生早于细胞形态学的变化，所以建立DNA分子水平的检测对早期疾病的诊断有很重要的作用。常见的检测方法有凝胶电泳和原位切口末端标记法。
2.2.1 凝胶电泳的检测 ①原理。凋亡发生时，Ca2＋和Mg2＋浓度升高，可激活细胞内的核酸内切酶，导致细胞核DNA双链的断裂。形成大小为180bp～200bp倍数的寡核苷酸片断，进行凝胶电泳分析，可发现典型的梯状带。②结果判定。提取凋亡细胞的DNA片段，并且使其纯化，加样，进行琼脂糖凝胶电泳，再经溴化乙锭染色，紫外灯下观察，可见凋亡细胞的DNA电泳后呈现独特的梯形图谱，而坏死的细胞提取纯化DNA，在进行电泳会出现模糊的连续膜状条带。
2.2.2 原位切口末端标记法的检测 ①原理。在凋亡发生早期，胞浆中Ca2＋和Mg2＋浓度升高，可激活核酸内切酶，在该酶的作用下，使染色质核小体间的DNA产生缺口，甚至发生断裂。此时末端脱氧核糖核酸转移酶(taggeddeoxynucleotide，TdT)能催化DNA链的3′OH端加到脱氧核糖核苷酸(deoxyribotide，dNTP)上发生聚合反应，再将地高辛的配基偶联于dNTP，在TdT酶的催化下，dNTP与地高辛配基偶合的核苷酸基团可加合到DNA缺口或断端处的3′OH上，同时释放出焦磷酸。再使用荧光素标记的地高辛抗体，通过抗原抗体反应与地高辛配基结合，再通过3′3二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)作为底物进行显色。即可在普通光学显微镜下观察到其染色质DNA存在缺口或断裂的细胞[10]。②结果判定。活细胞的细胞核在苏木精复染后呈蓝色，核相对较大，形状、大小较为一致。凋亡细胞的细胞核中出现碎点，核的形状不规则，大小不一。该方法操作简单、省时、敏感性可靠，一些科研工作者常用该方法检测细胞的凋亡。严玉霖等[11]在研究内毒素对肝细胞损伤的过程中，利用该方法检测到肝细胞发生了凋亡。
2.3 流式细胞仪(FCM)检测
用FCM检测细胞凋亡既可定性又可定量，且具有操作简单、快速和敏感等许多优点。但是检验样品前，必须要通过调试流式细胞仪的阈值，排除细胞碎片，获得单细胞悬液，才能更好的检测。所以该方法检测细胞凋亡的关键是样品制备。①原理。细胞在通过流式细胞仪激光焦点时可以发生光的散射，可以通过对不同角度反射光的分析，可以得到细胞大小、形状和结构的变化[12]。凋亡的细胞经碘二乙氧磷酰硫胆碱(phospholineiodide，PI)、烟酸己可碱(hoechst)等亲DNA染料可染出相应颜色，并且结合的染料与DNA含量成正比，即细胞激发后发射荧光强度与结合的染料的量成正比，因此可以定量检测。②结果判定。活细胞的细胞膜是完整的而不被着色，而坏死和凋亡细胞由于失去完整性容易被着色。正常细胞呈弱蓝、弱红光；凋亡细胞呈强蓝、弱红光；坏死细胞呈弱蓝、强红光[13]。
2.4 细胞凋亡酶学检测
细胞凋亡时，细胞膜破裂前，胞浆中出现大量的单或寡核苷酸核小体，而核小体由组蛋白及其伴随的片段组成。利用核小体进行的酶学检测而建立了夹心酶联免疫吸附法(enzymelinked immunosorbentassay，ELISA)。该方法更具有特异性、高敏感性，较少的细胞就可获得结果。现在有些科研工作者根据发生凋亡时细胞凋亡蛋白酶(caspase3)酶系统的活化[14]，其水解作用可以活化胞浆内多种成分和核内的一些成分，利用此过程建立了诊断方法。①原理。其原理与常规ELISA一致，利用单克隆抗体特异性定量测定凋亡过程中裂解的单核小体或寡核苷酸小体。②结果判定。利用公式[15]：EF＝凋亡样本的mU值(发生凋亡的细胞)/相应正常样品的mU对照值mU＝吸收值(103)＝双孔吸收值的平均OD值－底物OD值，若样品的吸收值超过比色测定范围，应适当稀释后再检测。
式中EF为释放到细胞浆中的单或寡核苷酸小体的特异性增加量。
3 问题与展望
选择哪种方法进行细胞凋亡检测，不仅决定所研究凋亡的类型、所处的时期、以及凋亡发生的原因，也要考虑到要达到的目标，预期想获得什么样的结果等等去考虑用何种方法进行检验。所以，对凋亡检测方法的选择应根据自己的情况而定。一般说来，早期细胞凋亡的确定可采用夹心酶联免疫吸附法(ELISA法)检测，晚期细胞凋亡可用原位末端标记法、凝胶电泳的检测等。如果需要定量检测分析细胞凋亡，则采用流式细胞仪比较准确可靠。虽然对细胞凋亡检测的方法越来越多，但是单独使用一种方法检测会出现假阳性，所以需要选择多种方法，综合各种方法的优点(即发展多参数检测方法[16])一起检测细胞凋亡，才能获得更准确的结果。随着人们对细胞凋亡机理认识层次的深入了解，相信将来肯定会出现一些敏感性高、特异性强、操作简单的检测方法。