MicroRNA与动物病毒性疾病研究进展

摘　要：microRNA (miRNA)是小分子RNA家族中的一员，内源性非编码基因构成的21 bp～23bp单链小RNA分子，在生物进化过程中保持了高度的保守性，通常由Dicer酶从具有发夹二级结构的RNA前体加工而来。miRNA虽然微小，但它在真核生物发育和基因表达中通过与靶mRNA形成完全或不完全互补配对从而扮演着重要角色。它们参与动物体发育、细胞增殖与死亡、细胞分化、激素分泌、肿瘤形成等各种过程。文章综述了病毒编码的miRNA以及miRNA在最新研究中的预测、表达和功能。

关键词：miRNA；细胞毒性T细胞；siRNA；病毒学

近些年来，人类发现了许多不同种类的RNA分子，其中真核生物中存在的两种主要非编码RNA (nocodingRNA，ncRNA)小分子，即小干扰RNA(siRNA)和microRNA(miRNA)分子，它们的发现引起了生物学家的广泛关注。miRNA是新近发现的一类小分子，最早发现的miRNA基因是线虫(Caenorhabditiselegans)中控制发育时序的lin4基因，它编码一段22bp长的RNA片断，调控其靶基因lin14和lin28的表达，对线虫的发育起着重要作用；2000年，又发现了let7基因，调控其靶基因lin41和hbl1的表达[1­2]。随后在秀虫、果蝇(Drosophilamelanogaster)、鱼、蛙、哺乳动物中都发现了类似的微小RNA，现在对数种模式生物(人、小鼠、果蝇、线虫、拟南芥)的miRNA所做的研究已经非常深入。科学家将这些约21bp～23 bp、呈现时空特异性表达模式的RNA分子，包括lin4和let7命名为microRNA(miRNA)，像RNA干扰，它们也能通过类似的甚至可能是相同的RISC分子影响基因的表达，尽管许多问题还尚待研究，但对这些miRNA的基因序列、加工机制、功能等方面的研究表明，它们具有重要的调控功能，与生物体的抗病毒作用、某些疾病的发生和生长发育密切相关[3]。

1　miRNA

1.1　miRNA的特征

miRNA是一些非编码的单链小RNA分子，具有以下几个显著的特点：①广泛存在于真核生物中，本身不具有开放阅读框(ORF)，是一组不编码蛋白质的序列；②通常长度为21bp～23 bp，但在3′端有1个～2个碱基的长度变化(miRNA具体长度尚无统一标准)；③成熟的miRNA5′端有一磷酸基团，3′端为羟基，这一特点可以和大多数功能RNA降解片段和寡核苷酸区别开来；④大多数miRNA在各个物种间具有高度的进化保守性，在线虫中所发现的miRNA85%都可以在C.briggsae基因组中找到同源序列，同样，拟南芥中也有miRNA与水稻中的miRNA找到了完全一样的序列，在拟南芥、水稻和烟草中也发现mir171相似序列[4]。⑤许多miRNA在表达上具有组织特异性。实验显示，在组织培养的S2细胞(Schneider­2细胞)可发现miR­12等，却无法找到miR­3～miR­6；类似地，miR­171(miR­39)在拟南芥的花序和花组织中高水平表达，而在茎、叶组织中却没有表达的迹象[5]。⑥大多数已发现的miRNA的表达都具有时序性。如mir­3～mir­7基因只在果蝇早期胚胎形成时表达，而miR­1、miR­8和miR­12的含量在果蝇幼虫阶段急剧上升并在成虫期维持在较高水平，与此同时，miR­9和miR­11的含量却急剧减少。基因表达的严格或不严格时序性，表达水平的显著变化，以及所在组织和细胞的特异性，都暗示着miRNA可能参与了深远而复杂的基因表达调控，并决定发育和行为等的变化[6­7]。

1.2　miRNA的成熟及其作用机制

动物中miRNA时序性加工成熟一般分为三步：第一步，在核内，在细胞核内编码miRNA的基因转录成前体miRNA(pri­miRNA)这一步还知之甚少；第二步，也在核内，在核糖核酸酶drosha[8]的参与下，将前体miRNA加工为70nt～90nt的具有茎­环二级结构的miRNA前体(pre­miRNA)，后被exportin5蛋白移送到细胞质；第三步，在细胞质中，在核糖核酸酶Dicer(双链RNA专一性RNA内切酶)作用下将茎­环的二级结构前体加工为成熟的miRNA。植物与动物的miRNA加工成熟过程是不同的，在植物中，不存在drosha与exportin5这些蛋白，因此，miRNA加工成熟过程均在细胞核内完成[9]。

合成成熟miRNA之后，首先，成熟miRNA与其互补序列互相结合成双螺旋结构，随后，双螺旋解旋，其中一条结合到RNA诱导的基因沉默复合物(RNA­inducedsilencing complex，RISC)中，形成非对称RISC复合物(asymmetric RISCassembly)，该复合物可以结合到目标靶mRNA上，大多数情况下，成熟的miRNA作用的靶位点主要是3′端的非编码区，通过与靶mRNA部分碱基完全或不完全互补配对发挥调控作用[10]。在动物中，当miRNA与靶mRNA不严格的碱基配对时，则抑制mRNA的翻译[11­12]，此时并不诱导mRNA的降解，当miRNA和靶mRNA完全互补时，它就能进入RNAi途径并且引导靶mRNA降解而不是抑制翻译；在大多数植物中，miRNA和靶mRNA完全互补配对最终导致了靶mRNA的降解。HumphreysDT等[13]通过非编码区有四个不完全互补的miRNA结合位点的Hela细胞转染同源miRNA，发现miRNA抑制真核生物的起始因子4E/cap和poly(A)尾的功能，从而控制转录的起始。

2　miRNA和siRNA的区别与联系

siRNA和miRNA的共同点：具有类似的长度；它们都是Dicer酶的产物；在干扰、调节作用时都会和RISC复合体结合；都可以在转录后和翻译水平干扰以抑制靶标基因的翻译。两者不同点：首先，siRNA来源是长链dsRNA(通常为外源)，而miRNA是单链，内源性，来自于基因组DNA的非编码区，存在于小的单链发夹状转录前体。其次，siRNA能精确识别位于外显子区域的互补靶序列，通过其反义链和靶mRNA共同组成RNA诱导沉默复合物(RISC)，导致靶序列的降解而诱导RNA干扰(RNAi)，而miRNA作用的靶位点主要是3′的基因非编码区，通过与靶mRNA不完全碱基互补配对，抑制mRNA的翻译，当miRNA与靶序列完全互补配对时，也能进入RNAi途径，触发靶序列的降解，也就是说，miRNA和siRNA的功能在某种意义上是可以互换的，两者与靶mRNA作用结果关键在于小RNAs与靶mRNA相互作用是完全还是不完全互补配对。在大多数植物中，miRNA的作用方式与内源性siRNA相似，而动物的miRNA作用方式则有所不同[14­15]。

3　miRNA与病毒的致病性

3.1　病毒感染

miRNA是一种类似siRNA的小分子RNA，它也可以通过与靶mRNA完全互补结合而达到灭活一个特定基因的功能，在病毒感染细胞的过程中，一般认为宿主细胞编码的小分子RNA可以起到一个潜在的抗病毒作用，它可以通过与病毒的靶mRNA结合从而灭活RNA病毒。然而，研究发现宿主细胞编码miRNA对抗病毒感染的同时，病毒本身的基因组也可以编码自己的miRNA攻击宿主细胞的防御系统[16]。

病毒感染性疾病是一类严重危害动物健康的疾病，病毒感染的清除主要依赖特异性体液免疫及细胞免疫应答，其中后者在抗病毒感染中尤为重要，而细胞免疫应答则主要依赖细胞毒性T细胞(CTL)参与[17­18]。SullivanC S等[19]研究表明，猿猴病毒(Simian virus40，SV­40)编码的miRNA在病毒感染的后期聚集，与病毒靶mRNA完全互补结合，使这些mRNA被切除，这降低了病毒T抗原的表达，但缺少SV­40miRNA的突变株却表明未随之降低，细胞毒性T细胞(CTL杀伤性T细胞)，是一类具有CD8＋表面标志、受MHCⅠ类分子限制的杀伤性功能的T细胞，它的主要功能是可以特异性地杀伤靶细胞，通过特异性CTL识别、杀伤、破坏病毒感染的细胞，清除胞内感染的病毒，这样特异性CTL应答在清除病毒感染作用中将大为减弱，野生型SV­40突变株对CTL有着更低的敏感性，这样特异性CTL应答在清除病毒感染的作用中将大为减弱。GuptaA等[20]研究认为HSV­1LAT基因编码miRNA通过调节TGF信号系统调控被感染细胞的调亡。但也有研究表明病毒在进化过程中从miRNA途径获益增强病毒的成功感染，而miRNA靶序列的变异，影响核苷酸向miRNA5′端结合，从而病毒嵌合体逃脱RNA沉默干扰[21]。

自从发现RNA干扰以来，认为这种机制在病毒防御中起作用的可能性就已提出，现有越来越多的证据也表明miRNA与病毒感染有关。DunnW等[22]证明，在病毒感染期间，人巨细胞病毒(Humancytomegalovirus，HCMV)表达异常miRNA，还发现这些miRNA在不同细胞种类中具有保守性，认为它们在病毒基因组中代表着基因的原始特征，病毒编码的miRNA比先前认为的要相似得多，预测许多这些miRNA参与抑制抗病毒反应。CouturierJP等[23]预测HIV编码miRNA下游调控CD4、CD28和一些白细胞介素，来减弱CD4、CD28和一些白细胞介素在动物体内作用。nef编码的miRNA通过RNA干扰途径调控人类免疫缺陷性病毒(HIV)的转录[24]。

3.2　病毒性疾病

Lecellier CH等[25]将PFV­1病毒所含有的病毒基因序列与一种附有报告基因绿色荧光蛋白(GFP)链接在一起，然后使它们与人体胚胎肾脏细胞一起染上病毒，结果显示，F11架构中的绿色荧光蛋白与F11mRNA聚集中所含有的绿色荧光蛋白比例完全不同。同时，他们利用DIANA­microT运算法则计算后发现F11序列与人体miR­32具有高度的相似性。进一步的研究表明，miR­32沉默受到P19表达细胞的压抑。同样，受抗miR­32细胞控制的核酸低聚核苷酸使子代病毒的繁殖量增加了一倍，并不是像抗miR­32细胞所起的作用一样。这意味着miR­32起着直接反病毒作用。CtherineJ等[26]以miRNA 122(mir­122)这种占肝脏miRNA70%比例的小RNA为研究对象，在Huh7肝脏细胞系转染mir­122的互补序列来沉默mir­122，发现mir­122失活后，丙型肝炎病毒RNA复制子的数目减少80%，研究发现丙型肝炎病毒mRNA5′非编码区域与肝脏中丰富表达的miRNA122(mir­122)相互作用，而肝脏就是丙型肝炎病毒复制的地方，这个相互作用导致丙型肝炎病毒RNA的增加，也可能导致丙型肝炎病毒在肝脏的长时间存在，人们设想将这个miRNA的活性去掉可能是一个有用的治疗丙型肝炎的方法，该方法的实施也许对全世界约1.7亿丙型肝炎病毒感染者将是一个福音。

病毒诱导型疾病通常会导致发育性畸形，ChellappanP等[27]用喀麦隆系非洲木薯花叶病毒(ACMV)中联体病毒蛋白编码的AC4蛋白在转基因植物中表达，发现AC4是罕有的病毒编码的后转录基因沉默抑制蛋白，它与成熟的果蝇miRNA结合后，阻止miRNA对其靶细胞的正常的调控，导致果蝇发育缺陷。

4　展望

过去，非编码RNA一直被人们忽视，直到最近几年发现它们具有越来越多的功能，从最初的siRNA介导的RNAi被发现到现在miRNA被发现在生物体内起到许多重要作用。近几年，对miRNA的研究取得了很大的进展，特别是miRNA在发育与疾病中的作用。目前对miRNA的研究尚处于初始阶段，不少基因还未被发现，发现的大多数基因的功能和作用机制还不清楚，其在发育和疾病中的作用，很多还处于假设推断阶段，miRNA变异还尚未在病理学中得到证实。因此，目前主要的工作还是不断发现新的miRNA并弄清其作用机制，这样可使人们对某些疾病的认识不断深化。据推测，人类三分之一的mRNA都被miRNA调控，随着它们的作用机理逐步明了，相信将在医学、兽医学及农业等领域给人类带来更多的福音。