动物体内存在的大量细菌对宿主动物的健康维持和营养有着重要的作用。肠道微生态与宿主动物营养的关系是近年来营养研究的热点。研究认为，动物体内的细菌已经大量产生耐药性，而目前细菌耐药性研究的焦点集中在耐药机制和耐药性的消除上，针对已产生耐药性细菌的营养代谢研究尚未见报道。另有研究认为持续低剂量的抗生素更易引起细菌耐药性的发生，饲用抗生素对肠道细菌的耐药性是否可以累积，值得进一步研究证实。本研究选用3种饲用抗生素，探讨了已产生耐药性的大肠杆菌对抗生素还能有多大的耐受力，并比较了耐药菌和野生菌在防病促生长剂量的饲用抗生素环境中的代谢差异。
1材料与方法
1．1试验材料本试验选用大肠杆菌国际标准菌株ATCC25922和四川地区优势菌株猪源致病性大肠杆菌O8血清型(菌种来源于四川农业大学微生态实验室，野生型大肠杆菌)，以及这两种血清型大肠杆菌的体外诱导型耐药菌株(方法见1．4．2，诱导型大肠杆菌)。
1．2试验设计本研究选用试管培养法，挑单个菌落在普通肉汤培养液中进行培养。每支试管吸取9 mL培养液和l mL配制好的抗生素，使得最终浓度为抗生素的防病促生长剂量浓度，在37℃的恒温水浴振荡器中培育l8 h后终止培养，每个处理3个重复。
1．3检测指标及方法将终止培养的细菌培养液于室温3 000 r／min离心l0 min，取上清液测总氨基酸产量、蛋白产量、乳酸产量(试剂盒法，购自南京建成)，每个重复分别作2个平行。
取离心后的沉淀，加2 mL灭菌蒸馏水稀释后，冰浴条件下于超声波破碎仪破碎，规格为5 s，每次破碎3 min，检测细菌内Na+-K+-ATP酶活性和NO含量(试剂盒法，购自南京建成)。
1．4体外诱导大肠杆菌产生耐药性试验方法
1．4．1 菌种复苏所得野生型菌种为冷冻菌种，在普通琼脂培养基上活化24 h，挑单个菌落移入普通肉汤培养基中，恒温水浴震荡12 h，用稀释滴种法记数，检测菌液浓度，用培养液将菌液稀释至悬液活菌含量约为105～108cfu／mL(colony—forming units，CFU，菌落形成单位)，置于4℃冰箱保存备用。
1．4．2人工诱导耐药性大肠杆菌的产生 分别在含1／2×MIC浓度的3种抗生素(诱导剂)的普通琼脂培养基接种适量细菌(约105 cfu)，37℃培养24 h，挑选生长良好(菌落较大，表面光滑)的菌落，接种于1×MIC诱导剂的培养基，37℃培养24 h，以此类推，逐渐提高培养基中诱导剂的浓度直到诱导前MIC的128倍(据细菌生长情况诱导剂浓度提高幅度在1-2倍于原浓度的范围适当调整，或当细菌生长不良时的同一个浓度重复代培养)。
1．5耐药型大肠杆菌对抗生素的敏感性变化分析和耐药程度分析步骤
1．5．1 大肠杆菌对3种抗生素的最低抑菌浓度(MIC值)和最小杀菌浓度(MBC值)测定测定野生型和诱导型大肠杆菌MIC值和MBC值。具体操作参照周淑兰试验方法。
1．5．2诱导型耐药菌株对3种抗生素交叉敏感性测定方法同上。
1．5．3诱导型耐药菌株的稳定性检测 将耐药菌株接种在无抗菌药物普通琼脂培养基，37℃恒温箱培养，每l8 h传代l次，连续培养l0代，然后进行药物敏感性测定(MIC和MBC的测定，下同)，检测耐药菌的遗传稳定性。
1．5．4诱导型耐药菌株的耐药程度分析将耐药菌株接种在含防病促生长剂量的抗生素普通琼脂培养基中，37℃培养，每l8 h传代l次，连续培养l0代，然后进行药物敏感性测定，检测细菌耐药程度是否发生变化。
1．6统计分析所有数据均使用SPSSll．5统计软件进行单因子方差分析，结果用平均值±标准差表示。
2结果与分析
2．1 耐药型大肠杆菌的耐药程度检测
2．1．1 耐药型大肠杆菌对抗生素的药敏变化 由表2、3可知，吉他霉素诱导大肠杆菌产生耐药性以后，明显提高了大肠杆菌的MIC值(MIC变化值≥4×MIC具有显著性意义)，与野生株MIC值相比提高了8倍，金霉素诱导株的MIC值提高了l28倍，诱导后大肠杆菌的MIC值增大为l70 444．8μg／mL，泰乐菌素诱导后提高大肠杆菌MIC值16倍。
表4显示，各个抗生素诱导耐药性菌株对不同抗生素的MIC值均有明显提高。吉他霉素诱导株对3种抗生素的耐药性增加了8～32倍，金霉素诱导株提高了64～128倍，泰乐菌素提高了8～64倍，证明每种耐药菌株均产生明显耐药性。
2．1．2耐药型大肠杆菌对抗生素的耐受程度 由表5可知，已诱导产生耐药性的大肠杆菌菌株在含防病促生长剂量抗生素浓度的培养基继续培养l0代后，MIC和MBC值与培养前相比(表3)均未发生明显变化。
2．2 饲用抗生素对耐药型大肠杆菌代谢的影响由表6可见，大肠杆菌产生耐药性以后，继续使用防病促生长剂量饲用抗生素，与野生型相比，总蛋白质产量和总AA产量均提高，不同抗生素有相同的提高趋势，不同血清型趋势亦相同。吉他霉素、金霉素、泰乐菌素诱导株中，血清型l的总蛋白产量分别提高21．17％(P>0．05)，59．8％(P<0．05)，41．4％(P>0．05)，血清型Ⅱ分别提高提高20．1％(P>0．05)，40％(P>0．05)，56．2％(P>0．05)。总AA产量各个处理组趋势相同。
大肠杆菌产生耐药性以后，与野生菌株相比，各个抗生素处理的乳酸产量均有提高。吉他霉素诱导株中，血清型l产生耐药性后乳酸产量增加l3．2％(P>0．05)，血清型Ⅱ的产量增加7．4％(P>0．05)；金霉素诱导株中，血清型I乳酸产量显著增加25．3％(P<0．05)，血清型Ⅱ的产量显著增加27．9％(P<0．05)；泰乐菌素诱导株中，血清型Ⅱ的乳酸产量显著增加26．9％(P<0．05)。
另外，大肠杆菌产生耐药性后，Na+-K+-ATP酶活性和N0产量与野生型大肠杆菌相比，均得到显著(P<0．05)或极显著增加(P<0．01)。其中，吉他霉素诱导株血清型l、Ⅱ的Na+-K+-ATP酶活性分别增加了108．5％(P<0．01)和79．9％(P<0．01)；金霉素组增加了52．6％(P<0．01)和17．7％(P>0．05)；泰乐菌素组提高了l34％(P<0．01)和191％(P<0．01)。而N0产量中，所有抗生素诱导株的N0产量与野生菌相比均极显著提高(P<0．01)。
3讨论
3．1 饲用抗生素诱导耐药性机制以及耐药性大肠杆菌对其耐受性分析研究认为，持续低浓度的抗生素更易诱导细菌产生耐药性，其机制如下(以大环内酯类抗生素为例)：大环内酯类药物的抗菌机制主要是其作用于细菌细胞核糖蛋白体50s亚单位，阻碍细菌蛋白质合成，抑制蛋白质合成的浓度为10-7～10-6mol／mL，而诱导耐药的最适浓度则至少低1个数量级。其耐药机制之一为甲基酶的产生，阻止细菌与药物的结合。在调节耐药性诱导的区域的5’端，甲基酶编码区隐藏在mRNA的一个襻中，处于无活性状态。当低浓度抗生素结合于mRNA上，导致l9个氨基酸的控制肽翻译受阻，mRNA发生构象重组，暴露出隐藏的甲基酶编码区，产生活化的甲基酶。而高浓度的药物进入菌体，与50 S亚单位结合，占据了绝大部分核蛋白体，合成甲基酶编码区落入其中，既可抑制蛋白质合成，又可诱导甲基酶合成与转化，但是药物浓度低时，不能饱和核蛋白体，则mRNA 5 ’端的控制区域受损，仅致活甲基化酶，产生耐药。利用体外诱导金黄色葡萄球菌的方式证明，细菌在1／2×MIC时抗生素环境中即出现高度耐药菌株，说明细菌在低浓度药物环境中更易产生耐药性，而细菌耐药性的增加是一个逐步扩大的过程，到达一定程度以后，将不再累加，这可能是细菌发生点突变或其他发生方式获得固有耐药性并稳定遗传的结果。与本试验结果一致，即细菌产生耐药性以后，饲用抗生素的继续使用不再增加其耐药性。
3．2饲用抗生素对耐药性大肠杆菌信号转导的影响一氧化氮在哺乳动物的细胞信号作用和免疫响应中发挥重要功能，基因组测序研究显示细菌同哺乳动物一样也存在一氧化氮合成酶(NOS)，一氧化氮(NO)在细菌中作为一种信号转导分子，同样起着信使的作用。近年来研究发现，细菌可以通过被称为“自身诱导物”的特定信号分子的浓度，监测周围环境中自身与其他细菌的数量变化，当信号分子浓度随着群体密度的增加达到一定浓度阀值时，会启动信号级联反应进而调控群体的基因表达，从而使细菌适应环境的变化，这一系统被称为细菌的群体感应(quorum—sensing，QS)系统，N0可能在其中有着重要的作用。本研究中，当细菌产生耐药性以后，与野生菌株相比，N0的产量极显著提高(P<0．01)，推测耐药菌株在低浓度的抗生素环境中，通过一系列方式变化使自身适应生存环境，信号转导作用增强可能是其中之一，最终结果是改变菌体的代谢活动。耐药菌信号转导的具体变化尚待进一步研究。
3．3饲用抗生素对耐药性大肠杆菌蛋白质代谢和能量代谢的影响在反刍动物的研究中发现，小肠氨基酸多数来源于瘤胃微生物，且瘤胃微生物蛋白的氨基酸组成十分平衡，消化率达80％，单胃动物肠道微生物同样有着提供氨基酸平衡的微生物蛋白的作用。因此，本试验用总蛋白质和总AA产量来衡量微生物的蛋白质代谢状况。一般认为，蛋白质产物增多是代谢活动增强的表现。本研究中添加的抗生素浓度较低(20～100 mg／L)，与本试验测得的野生型细菌的MIC相比差异较大(52～1 331μg／mL)，可能是该浓度抗生素并不能对野生型细菌发挥抑制生长的作用，而细菌产生耐药性以后，MIC值变大，抗生素更不能抑制细菌的生长。所以，耐药性大肠杆菌蛋白产物增多并不是细菌增殖的结果，根据蛋白质组学的观点，推测可能与细菌耐药基因的获得导致菌体代谢发生变化有关，另外，由于N0产量极显著增加，作者认为，蛋白质产物增多也可能是信号转导作用增强的结果。具体的证据尚需进一步的研究证明。
而乳酸和Na+-K+-ATP酶是衡量生命体能量代谢的2个指标。乳酸是细菌能量代谢的重要中间代谢产物，细菌生命活动所需能量基本来源于乳酸。ATP酶存在于组织细胞及细胞器的膜上，是细菌膜上的一种蛋白酶，具有质子转位和供应能量的作用。另外，在能量产生的过程中，每多产生1个乳酸即多产生l个ATP，伴随乳酸产量的增多，提示细菌产生更多的ATP，同时，Na+-K+-ATP酶的活性增强的结果也是细菌产生更多的ATP，ATP产量的提高提示着细菌能量需要的增多，间接说明细菌产生耐药性以后，其他生命代谢活动增强从而增加了能量的需要，也印证了本研究中蛋白质代谢活动增强和信号转导增强的试验结果。
