猪链球菌2型分离株对野生斑马鱼的致病性

摘　要：以野生斑马鱼为模式动物，对6株mrp^＋epf^＋sly^＋猪链球菌2型(SS2)分离株进行致病性比较。斑马鱼经腹腔接种不同稀释度的SS2分离株，连续观察5d，Kaplan-Meier生存曲线分析并统计半数致死量(LD₅₀)。结果显示，6个分离株对斑马鱼的LD₅₀在10⁵cfu～10⁶cfu之间，临床株与非临床株的毒力差异不显著(P>0.05)。从攻毒后死亡的鱼腹腔和脑可分离到SS2，并伴有腹腔出血及肝、肠、脑部炎性病变。表明SS2可感染斑马鱼，为进一步研究SS2的体内感染机制及毒力因子功能等奠定了基础。

关键词：2型猪链球菌；斑马鱼；致病性；半数致死量

猪链球菌(Streptococcussuis，SS)有35个血清型，其中以血清2型(SS2)致病力最强^[1]，是一种重要的人兽共患病病原，可以引起人和猪的猪链球菌病，已多次在国内暴发，造成巨大的经济损失^[2]。猪感染SS2后，可导致败血症、关节炎和脑膜炎等^[3]。SS2的致病机理目前尚不清楚，因此除通过体外研究其与细胞的相互作用之外，还需用模式动物来系统研究其致病机理。除传统的小鼠模型外，近年来还有学者试用仔猪或SPF猪作为SS2的动物模型，具有敏感、症状典型等特点，但也存在母源抗体干扰和隐性带菌等缺点，且对饲养管理要求较高。

斑马鱼(Daniorerio)是一种亚热带观赏鱼类，具有个体小、产卵周期短、产卵量高、体外受精与发育等特点，同时由于其与人类基因组具有较高相似性，也具有较完整的获得性和天然细胞免疫系统^[4-7]。目前已被广泛应用于发育生物学、毒理学、分子生物学和免疫学等领域的研究。本试验以野生斑马鱼作为模式动物，比较分析不同SS2分离株的致病性，为进一步研究SS2的感染机制和毒力因子的功能提供依据。

1　材料与方法

1.1　主要试剂

Todd-Hewitt肉汤(THB)购自OXOID公司；绵羊血购自浙江康裕制药有限公司；新生牛血清(FCS)购自杭州四季青生物工程材料有限公司；麻醉剂鱼定安(MS-222)购自上海布西化工厂；Taqplus购自北京

鼎国生物技术有限责任公司；dNTP购自上海博彩生物科技有限公司；DNA Marker DL 2000购自北京盈信阳光生物技术有限公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2　菌株与试验用动物

SS2型临床分离株5995和6035由丹麦国立兽医研究所AnersonK博士惠赠，国内分离株HN137、ZJXS033、ZJXS026和HZ0604为本实验室分离保存^[8]，所有菌株基因型均为mrp^＋epf^＋sly^＋。试验用野生斑马鱼购自市场，采用充分曝气的清水饲养，并在水循环和增氧条件下生活1周以适应环境。

1.3　斑马鱼攻毒试验

SS2于37 ℃振荡培养至OD₆₀₀0.3～0.4，离心收集菌体，PBS洗1次，调整细菌浓度为10⁸cfu/mL，并进行10倍连续稀释，平板计数以确定实际接种量。同时选取不同的稀释度腹腔接种经MS-222麻醉的斑马鱼，剂量为10μL/尾，每组接种20尾。对照组则注射等量PBS。注射后，各组分开饲养，水温保持在29 ℃至30℃之间，定时观察斑马鱼的发病和死亡情况，连续观察5 d。

1.4　细菌分离与鉴定

将死亡鱼在700 mL/L酒精中浸泡1 min后，无菌条件下剖开腹部，用接种环沾取腹腔液和脑组织接种至含60mL/L绵羊血的THB平板上。37℃培养过夜后，对灰白色、针尖状、呈β溶血的菌落进行革兰氏染色镜检，同时提取细菌基因组模板利用引物gdh-1/gdh-2和cps2j-1/cps2j-2进行特异性双重PCR鉴定^[8]。

1.5　组织病理学观察

参照文献[9]的方法制片并HE染色，用NIKON ECLIPSE 90i显微镜进行病理切片观察，并用NIS-Elements BRv2.30软件完成图像捕获。

1.6　统计分析

经GraphPad Prism 4制图并进行Kaplan-Meier生存曲线分析和logrank检验；利用DPS系统v7.55计算LD₅₀和进行显著性检验^[10]。

2　结果

2.1　生存曲线及半数致死量

通过对生存曲线的log rank检验发现，SS2各分离株在10⁶cfu与10⁵cfu剂量间的死亡率差异均显著(P<0.05)，而相同剂量组各株间毒力差异不显著(P>0.05)。10⁶cfu剂量组ZJXS033、ZJXS026、HZ0604的半数致死时间为12 h,5995、6035及HN137为16 h；10⁵cfu剂量组的半数致死顺序为ZJXS033(22 h) <6035(27 h)

图1　SS2分离株以10⁶cfu与10⁵cfu剂量腹腔感染斑马鱼的Kaplan-Meier生存曲线

Fig.1　Kaplan-Meiersurvivalcurves of zebrafish followingintraperitoneally infection at a dose of 10⁶and 10⁵cfu by SS2 isolates

对死亡数进行统计分析发现，这6株SS2的lg (LD₅₀)均在5至6之间，其置信区间互为重叠，差异不显著(P>0.05)(表1)，提示这些分离株对斑马鱼的毒力差异并没有很大区别，非临床株的致病力与临床株相近。

表1　SS2分离株对斑马鱼致病性(LD₅₀)

Table 1　Comparison of 6 SS2 isolates in the virulence to wildzebrafish

注：*为临床分离株。

Note：*Clinical isolates.

2.2　斑马鱼的临床及病理变化

SS2腹腔攻毒斑马鱼约12 h后，10⁶cfu组出现了胸腹部及肛门附近出血、腹部臌胀等症状。剖检可见腹腔积液、脏器出血，肝脏色泽淡黄。HE染色切片可观察到肝区炎症，肝细胞颗粒变性、坏死，肝小叶的正常结构消失，部分区域被淋巴细胞浸润(图2A和图2B)；肠道肿胀且黏膜脱落(图2C)；细菌侵入脑部血管，引起了脑膜炎(图2E)。而空白对照组以上部位没有出现明显的病理变化(图2D和图2F)。

A.死亡鱼的肝，显示大片坏死灶，方框为B放大区域；B.箭头所示肝区大量淋巴细胞浸润，肝索狭窄，肝细胞变性坏死；C.死亡鱼的肠，箭头显示肿胀和肠炎；D.对照鱼的肝与肠；E.死亡鱼的脑，箭头显示侵入脑血管腔内的细菌；F.对照鱼的脑；比例尺长度为50μm

A.Liver of infected fish，which shows a large region of necrosis.The square indicates region of magnification in B；B.Arrows showdegeneration of hepatic cells surrounded by denselymphocytes，andnarrow hepatic cords；C.Intestine of infected fish. The arrowindicates swollen intestinal canal and enteritis；D.Liver andintestine of control fish；E.Brain of infected fish. Arrows point toSS2 visible in the lumen of a vessel invading the brainparenchyma；F.Brain of control fish. Scale bar 50 μm

图2　野生斑马鱼感染SS2后的组织病理切片

Fig.2　Histopathological examination of wild zebrafish infected withSS2

2.3　细菌的再分离与鉴定

分别从感染死亡鱼的腹腔和脑部挑取病料划线接种至THB血平板，37℃培养过夜后，观察菌落形态，分离到的SS2为灰白色露滴状、β溶血，革兰氏染色为革兰氏阳性菌，呈链状。双重PCR结果证实了从死亡鱼中分离到的细菌为猪链球菌2型(图3)

M.DNA标准DL 2000；1～6.5995、HZ0604、6035、HN137、ZJXS033、ZJXS026腹腔分离株；7～12.5995、HZ0604、6035、HN137、ZJXS033、ZJXS026脑分离株；“＋”.SS2阳性对照；“－”.非2型SS；W.双蒸水空白对照

M.DNA Marker DL 2 000；1-6.5995，HZ0604，6035，HN137，ZJXS033，ZJXS026isolated from peritonedcavities；7-12.5995，HZ0604，6035，HN137，ZJXS033，ZJXS026 isolated frombrain；“＋”.SS2 positive control；“－”.Non-serotype 2 SS control；W.ddH₂O control

图3　死亡斑马鱼体内再分离的SS2的双重PCR鉴定

Fig.3　PCR amplification of thegdh andcps2jgene of the re-isolated SS2 strains from dead zebrafish

3　讨论

对SS2毒力因子的研究尚不够深入，且有关SS2的致病机理研究也较为欠缺。通过实验动物模型来了解该菌的致病机理十分必要。一些学者认为需要建立一套共同的标准来定义猪链球菌的致病力，其中包括一致的动物模型^[10]。

实验小鼠是较早用于SS2体内感染研究的动物模型^[11-12]。近年也有学者通过直接感染^[13-14]、黏膜接种^[15]等多种途径接种仔猪或SPF猪，研究了SS2的动态感染过程。但SS2存在着一定的宿主特异性，对鼠和猪的致病力存在差异^[16]。其他动物方面，家兔虽可感染SS2，但鲜有报道将其作为感染模型。

已有报道将斑马鱼用于研究多种病原菌和病毒引起的哺乳动物急性感染过程^[5]。Neely M等^[17]首次利用斑马鱼作为海豚链球菌(S.iniae)与化脓链球菌(S.pyogene)的感染模型，以期发现不同细菌在毒力上的差异^[17]。陆承平等^[18]首次报道利用纯系AB斑马鱼模型开展了猪链球菌致病力和免疫保护等方面的尝试。濮俊毅^[19]也利用该模型检测了mrp^＋epf^＋与mrp^–epf^-SS2的致病力。但国内作为实验动物的斑马鱼选育及养殖体系尚未完全建立，故本试验选用的是市售野生斑马鱼。在本研究中，6株来自不同地域的SS2临床株和非临床株对野生斑马鱼的毒力差异不显著，且lg(LD₅₀)高于mrp^＋epf^＋SS2强毒株对纯系斑马鱼的水平^[18]，这可能与分离株来源、斑马鱼的种类、接种剂量、免疫状况等因素有关^[20]。同时，斑马鱼感染SS2后出现了与猪自然感染的相似症状^[3]，包括典型的出血和实质器官炎症及脑炎，并可在死亡鱼的体内再分离到SS2。

在攻毒方式上，Pressley M E等^[21]用迟钝爱德华氏菌(E.tarda)对斑马鱼采用了浸泡、皮肤损伤后浸泡和腹腔注射接种等途径，发现在皮肤未破损的情况下，浸泡法不能成功攻毒。Novoa B等^[22]用病毒性出血性败血症病毒(VHSV)采用浸泡法攻毒，效果同样不理想。本试验同样尝试了这3种途径，最终仅腹腔注射有效，表明SS2一般不能通过鳃与皮肤途径直接感染斑马鱼，但某些细菌可感染受环境应激后的斑马鱼^[17]。在饲养条件上，本研究发现鱼群的生活温度和细菌毒力密切相关，水温处于25 ℃以下时，10⁶cfu的细菌在腹腔接种攻毒后不能造成斑马鱼死亡，这可能是由于在较低温度下细菌在鱼体内的繁殖缓慢，从而被鱼的免疫系统有效清除所致。

综上所述，野生斑马鱼能被SS2感染，若能保证供试鱼群的质量并维持饲养环境的稳定，可用于开展SS2体内致病机理和毒力因子功能等方面的研究。