摘 要：将化学合成的水貂生长激素基因mGH插入载体pVAX1，将经过PCR、酶切鉴定、测序正确的pVAX1-mGH重组质粒，注射到小鼠后肢的股四头肌，空白对照组注射PBS，于注射后5、10、20、40、60d，眼球采血，取注射部位的肌肉组织进行免疫组化研究，结果证明在胞浆中有特异性蛋白表达。
关键词：水貂生长激素基因；载体pVAX1；小鼠；股四头肌；免疫组化
哺乳动物生长激素(growthhormone，GH)是动物脑下垂体前叶分泌的单链多肽，其生理功能是促进碳水化合物代谢及核酸、蛋白质合成，整体效应表现为促进动物生长。利用生长激素基因，在提高物种的生产性能和生长速度方面取得了一定的成效。目前已经克隆出了人[1-2]、猪[3]、牛[4]、羊[5]、兔[6-7]等的生长激素基因，并用于生产实践，取得了较好的社会和经济效益。
水貂生长激素(Mustelavisiongrowthhormone，mGH)是由水貂的脑垂体分泌的一种多肽类激素，可显著提高水貂的生长速度，增加体长，从而提高水貂的毛皮质量。SereikaiteJ等[8]在大肠埃希菌中成功表达了mGH，由于表达产物缺少翻译后修饰，易折叠错误导致表达产物没有活性，需要进行复性，给后期的纯化带来一系列的问题。而DNA疫苗是20世纪90年代发展起来的一项崭新的免疫技术，由TangD C等[9]首次报道，随后引起了广泛的关注。它是把带有目的抗原基因的重组质粒转染到细胞中，使之在细胞内持续表达出天然的抗原物质，诱导强而持久的特异性细胞免疫及体液免疫应答，而不需要后期额外的糖基化、纯化、复性等系列的工艺处理，从而得到了广大科学工作者的重视，已经在感染性疾病、自身免疫性疾病及肿瘤防治等多方面取得了令人鼓舞的成果，被誉为第三次疫苗革命。
本研究利用基因疫苗载体pVAX1，构建重组质粒pVAX1-mGH，PCR、酶切、测序鉴定正确之后，注射到昆明小鼠后肢的股四头肌处，空白对照组注射PBS，于注射后5、10、20、40、60d，眼球采血，取注射部位的肌肉组织进行免疫组化观察，结果证明在胞浆中有特异性蛋白表达，而且持续表达的时间至少2个月以上，因此可以此为基础，进一步研究开发新型兽用DNA疫苗。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 质粒、细胞和菌株 载体pVAX1、BHK-21细胞、E.coliDH5α均为本实验室保存。
1.1.2 试剂 限制性内切酶(EcoRⅠ、HindⅢ)、T4 DNA连接酶、rTaq、DL 2 000 Marker、DL 6 000Marker、胶纯化回收试剂盒、质粒小提试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司；低熔点琼脂糖、蛋白胨、酵母提取物均购自Oxioid公司；去除内毒素质粒大提试剂盒、DAB增强显色试剂盒购自TIANGEN公司；LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司；TritonX-100、牛血清白蛋白(BSA)为Sigma公司产品；兔抗水貂生长激素抗体购自上海麦莎试剂公司；羊抗兔抗体购自北京中杉金桥生物技术公司；琼脂粉为日本进口分装；其他试剂均为国产分析纯。
1.1.3 仪器设备 Thermalcycler(Bio-Rad)，SCR-9稳压稳流电泳仪(国营丹阳无线电一厂)，隔水式恒温培养箱GHP-9080(上海一恒)，HZQ-X100震荡培养箱(哈尔滨市东明医疗器械)，超净工作台(哈东联)，冷冻离心机(GL-20B)，电热恒温水浴锅(龙口市先科仪器公司)，凝胶成像系统(美国UVP)，美国宝特BIO-TEKElx-800酶标仪，CO2培养箱(Thermo)，KD轮转式切片机(浙江金华科迪仪器设备有限公司)。
1.2 方法
1.2.1 人工合成水貂生长激素 根据GenBank sequenceaccession中已发表的水貂生长激素基因序列(序列编号E03430)，由宝生物工程(大连)有限公司合成mGH的序列片段，并与PMD-T载体连接，命名为PMD-mGH。之后，用LB琼脂平板活化菌株，提取PMD-mGH质粒，－20℃保存备用。
1.2.2 引物的设计与合成 根据人工合成的mGH基因序列，用Primer5.0设计1对特异性引物，上游引物为5′-GAATTCCCGGCCATGCCCTTGTCCAG-3′，下游引物为5′-ATAGCGGCCGCGAACTAGAAGGCACAGC-3′，在上游引物的5′端引入EcoRⅠ酶切位点(宝生物工程(大连)有限公司合成)，理论扩增片段约570 bp。PCR扩增反应条件为，99 ℃预变性5 min；4 ℃ 5min,95 ℃ 1 min；94 ℃变性45 s，60 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min，进行35个循环；最后72℃延伸10min。
1.2.3 重组质粒pVAX1-mGH的构建 将PMD-mGH用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，回收大小为570 bp的目的片段，并与同样双酶切回收的pVAX1在16℃过夜连接，转化DH5α菌株，提取质粒，进行PCR(反应条件同1.2.2)、双酶切鉴定，将鉴定为阳性的重组质粒送宝生物工程(大连)有限公司测序，并将获得的阳性重组质粒命名为pVAX1-mGH。
1.2.4 转染用重组质粒DNA的制备 将空质粒pVAX1和阳性克隆pVAX1-mGH的菌种均按1∶100比例接种于500 mL含50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基中，37 ℃振荡培养12 h～16 h。收菌后按质粒纯化试剂盒TIANGENPurification Plasmid操作说明进行纯化，将沉淀用700mL/L乙醇洗涤1次，干燥后溶解于适量PBS中，取少量1∶100稀释后于紫外分光光度计上测质粒浓度。置－20 ℃保存备用。
1.2.5 重组质粒在小鼠骨骼肌中的表达 大量提取重组质粒pVAX1-mGH并溶于PBS缓冲液中，测定OD260/OD280在1.8～1.9，调整浓度为1.0μg/μL，于－20℃保存。将5周龄～6周龄的昆明种雄性小鼠60只，随机分成2组，每组30只，即分别为注射pVAX1-mGH组和PBS组。先给所有小鼠按1μg/g(每克体重注射1 μg)的剂量于其右后肢股四头肌内注射100 μL 250mg/L的高渗蔗糖溶液(用PBS溶解)，以提高DNA的转染效率。24 h后，再给试验组每只小鼠的股四头肌处注射100μL的重组质粒pVAX1-mGH；PBS对照组每只小鼠的股四头肌处注射100 μL的PBS。于注射后5、10、20、40、60d每组分别随机取6只小鼠，从眼球采血，分离血清，置－20 ℃保存，以备ELISA检测。
1.2.6 免疫组化检测小鼠骨骼肌细胞中目的蛋白的表达 取重组质粒注射组和PBS对照组小鼠注射部位的肌肉组织，依次经100mL/L甲醛固定、水洗、逐级脱水、浸蜡、石蜡包埋、5 μm连续切片及切片脱蜡至水后，再放入30 mL/L H2O2中，浸泡10 min灭活内源性酶，再滴加柠檬酸盐缓冲液修复抗原。经50 mL/L BSA封闭液于室温20min后，依次滴加1∶100兔抗水貂生长激素抗体(4 ℃过夜，洗涤)及1∶500 HRP标记的羊抗兔IgG(于37 ℃孵育30min，洗涤)。以DAB显色10min后，用蒸馏水洗片3次；经逐级酒精脱水、二甲苯透明后，用中性树脂封片，镜下观察组织染色的结果并照相。
2 结果
2.1 重组质粒pVAX1-mGH的构建与鉴定
pVAX1-mGH重组质粒的构建见图1。pVAX1、pVAX1-mGH的PCR鉴定结果(图2)显示，使用特异性引物时空质粒没扩出任何条带而重组质粒扩增约570bp片段，与预计结果相符。对初步鉴定为阳性的重组质粒进行EcoRⅠ/HindⅢ双酶切后，10 g/L琼脂糖凝胶电泳，在3 000 bp和570bp处发现条带，与预计结果相符(图3)，经进一步测序表明序列及读码框均正确。
图1 重组质粒pVAX1-mGH的构建
Fig.1 Construction of recombinant plasmid pVAX1-mGH
2.2 免疫组化检测小鼠注射质粒部位骨骼肌中mGH的表达
注射质粒组可见mGH蛋白的表达(图4)，而注射PBS组未见mGH蛋白的表达(图5)。
M.DNA Marker DL 2 000；1-4.pVAX1-mGH；5. pVAX1
M.DNA Marker DL 2 000；N.DNA MarkerDL 6 000；1-4.pVAX1-mGH
图2 pVAX1、pVAX1-mGH的PCR鉴定
Fig.2 The PCR results of pVAX1、pVAX1-mGH
图3 pVAX1-mGH的EcoRⅠ/HindⅢ双酶切结果
Fig.3 The results of pVAX1-mGH digested byEcoRⅠ andHindⅢ
图4 mGH在注射重组质粒小鼠肌肉中的表达
Fig.4 The expression of mGH in muscle of mouseinjected withplasmids
图5 mGH在注射PBS小鼠肌肉中表达
Fig.5 No expression of mGH in the muscle of mouseinjectedwith PBS
2.3 ELISA检测小鼠血清中mGH的含量
ELISA检测小鼠血清中mGH的含量见表1。
表1 血清目的蛋白含量的ELISA检测
Table 1 ELISA analyses for the target protein contents in sera(n＝6)
组别 Groups | D490(±SD) |
注射PBS组 Injecting PBS | 0.075±0.006A |
注射重组质粒5 d Injectingrecombined plasmid after 5 days | 0.109±0.003A |
注射重组质粒10 d Injecting recombined plasmidafter 10 days | 0.240±0.015B |
注射重组质粒20 d Injectingrecombined plasmidafter 20 days | 0.343±0.012C |
注射重组质粒40 d Injectingrecombined plasmid after 40 days | 0.518±0.018E |
注射重组质粒60 d Injecting recombined plasmid after 60 days | 0.468±0.014D |
注：同一列标有不同大写字母的数据间差异显著(P<0.05)。
Note：Data labeled with the different capital letters showssignificant differences(P<0.05).
3 讨论
本试验利用核酸疫苗载体pVAX1构建出重组质粒pVAX1-mGH，注射昆明小鼠后肢的股四头肌，ELISA检测血清中蛋白的含量；免疫组化检测注射部位的肌肉组织。从试验的结果看，注射重组质粒的肌肉组织部位检测到了特异性的目的蛋白，说明mGH可以转染到小鼠的肌纤维并在其中得到表达，而且持续表达的时间至少2个月以上。证明mGH表达质粒能通过直接注射骨骼肌而在胞浆中获得特异性蛋白表达，为进一步研究mGH的蛋白功能以及水貂生长激素核酸疫苗的研究与开发奠定基础。
但在研究过程中，以免疫组化的方法检测目的蛋白时发现，检测到的阳性位点主要出现在注射点肌纤维束之间的间隙和肌膜的边缘，而注射点附近的肌肉基本上检测不到阳性位点。这些现象说明重组质粒的转染效率比较低，质粒在肌纤维间的扩散性较差，这可能与所采用的免疫策略有关。
另外，在很多研究中，肌肉注射DNA疫苗前常常采用布比卡因等局部麻醉剂或蔗糖高渗溶液对肌肉进行预处理，其目的是使肌肉松弛或使肌纤维坏死，而松弛的肌肉或再生的肌纤维有利于DNA疫苗的扩散和提高转染效率[10-11]。Davis H L等在给小鼠接种质粒DNA前15 min～30 min时，注射250g/L的高渗蔗糖溶液(用PBS溶解)，结果外源基因表达水平高于对照组。Davis HL认为，高渗蔗糖溶液可导致组织水肿而使肌束间隙变大，肌纤维通透性增加，这有助于DNA在组织内扩散和进入到肌纤维。本试验采用蔗糖处理注射部位的肌肉组织，得到了满意的结果，说明蔗糖在此过程中确实起到了一定的作用。
虽然本研究证实pVAX1-mGH可以转染小鼠的肌纤维并在其中得到表达，但研究中所采用的注射剂量是否最佳，免疫前对肌肉进行预处理是否影响质粒转染及表达效率等问题，还需要进一步的定量分析才能得出结论。
, mso-bid: \'Courier New\'">1∶500 HRP标记的羊抗兔IgG(于37 ℃孵育30min，洗涤)。以DAB显色10min后，用蒸馏水洗片3次；经逐级酒精脱水、二甲苯透明后，用中性树脂封片，镜下观察组织染色的结果并照相。
2 结果
2.1 重组质粒pVAX1-mGH的构建与鉴定
pVAX1-mGH重组质粒的构建见图1。pVAX1、pVAX1-mGH的PCR鉴定结果(图2)显示，使用特异性引物时空质粒没扩出任何条带而重组质粒扩增约570bp片段，与预计结果相符。对初步鉴定为阳性的重组质粒进行EcoRⅠ/HindⅢ双酶切后，10 g/L琼脂糖凝胶电泳，在3 000 bp和570bp处发现条带，与预计结果相符(图3)，经进一步测序表明序列及读码框均正确。
图1 重组质粒pVAX1-mGH的构建
Fig.1 Construction of recombinant plasmid pVAX1-mGH
2.2 免疫组化检测小鼠注射质粒部位骨骼肌中mGH的表达
注射质粒组可见mGH蛋白的表达(图4)，而注射PBS组未见mGH蛋白的表达(图5)。
M.DNA Marker DL 2 000；1-4.pVAX1-mGH；5. pVAX1
M.DNA Marker DL 2 000；N.DNA MarkerDL 6 000；1-4.pVAX1-mGH
图2 pVAX1、pVAX1-mGH的PCR鉴定
Fig.2 The PCR results of pVAX1、pVAX1-mGH
图3 pVAX1-mGH的EcoRⅠ/HindⅢ双酶切结果
Fig.3 The results of pVAX1-mGH digested byEcoRⅠ andHindⅢ
图4 mGH在注射重组质粒小鼠肌肉中的表达
Fig.4 The expression of mGH in muscle of mouseinjected withplasmids
图5 mGH在注射PBS小鼠肌肉中表达
Fig.5 No expression of mGH in the muscle of mouseinjectedwith PBS
2.3 ELISA检测小鼠血清中mGH的含量
ELISA检测小鼠血清中mGH的含量见表1。
表1 血清目的蛋白含量的ELISA检测
Table 1 ELISA analyses for the target protein contents in sera(n＝6)
组别 Groups | D490(±SD) |
注射PBS组 Injecting PBS | 0.075±0.006A |
注射重组质粒5 d Injectingrecombined plasmid after 5 days | 0.109±0.003A |
注射重组质粒10 d Injecting recombined plasmidafter 10 days | 0.240±0.015B |
注射重组质粒20 d Injectingrecombined plasmidafter 20 days | 0.343±0.012C |
注射重组质粒40 d Injectingrecombined plasmid after 40 days | 0.518±0.018E |
注射重组质粒60 d Injecting recombined plasmid after 60 days | 0.468±0.014D |
注：同一列标有不同大写字母的数据间差异显著(P<0.05)。
Note：Data labeled with the different capital letters showssignificant differences(P<0.05).
3 讨论
本试验利用核酸疫苗载体pVAX1构建出重组质粒pVAX1-mGH，注射昆明小鼠后肢的股四头肌，ELISA检测血清中蛋白的含量；免疫组化检测注射部位的肌肉组织。从试验的结果看，注射重组质粒的肌肉组织部位检测到了特异性的目的蛋白，说明mGH可以转染到小鼠的肌纤维并在其中得到表达，而且持续表达的时间至少2个月以上。证明mGH表达质粒能通过直接注射骨骼肌而在胞浆中获得特异性蛋白表达，为进一步研究mGH的蛋白功能以及水貂生长激素核酸疫苗的研究与开发奠定基础。
但在研究过程中，以免疫组化的方法检测目的蛋白时发现，检测到的阳性位点主要出现在注射点肌纤维束之间的间隙和肌膜的边缘，而注射点附近的肌肉基本上检测不到阳性位点。这些现象说明重组质粒的转染效率比较低，质粒在肌纤维间的扩散性较差，这可能与所采用的免疫策略有关。
另外，在很多研究中，肌肉注射DNA疫苗前常常采用布比卡因等局部麻醉剂或蔗糖高渗溶液对肌肉进行预处理，其目的是使肌肉松弛或使肌纤维坏死，而松弛的肌肉或再生的肌纤维有利于DNA疫苗的扩散和提高转染效率[10-11]。Davis H L等在给小鼠接种质粒DNA前15 min～30 min时，注射250g/L的高渗蔗糖溶液(用PBS溶解)，结果外源基因表达水平高于对照组。Davis HL认为，高渗蔗糖溶液可导致组织水肿而使肌束间隙变大，肌纤维通透性增加，这有助于DNA在组织内扩散和进入到肌纤维。本试验采用蔗糖处理注射部位的肌肉组织，得到了满意的结果，说明蔗糖在此过程中确实起到了一定的作用。
虽然本研究证实pVAX1-mGH可以转染小鼠的肌纤维并在其中得到表达，但研究中所采用的注射剂量是否最佳，免疫前对肌肉进行预处理是否影响质粒转染及表达效率等问题，还需要进一步的定量分析才能得出结论。