H3N2亚型猪流感病毒HA基因序列测定及抗原性分析

摘　要：采用RT­PCR技术对4株H3N2亚型猪流感病毒的HA基因进行了扩增，将获得的PCR产物分别与pMD18­T克隆载体连接，进行序列测定。测序结果显示，4个毒株均含有完整的开放阅读框，并且均未发现核苷酸插入或缺失现象；分离毒株间核苷酸同源性为99.4%～99.7%，氨基酸同源性为98.2%～99.3%。同源性分析表明，4个毒株与2003年的猪流感病毒广东分离株有很高同源性(均在99%以上)，说明近段时间我国H3N2亚型的猪流感病毒变异不大，重组的频率不是很高，同时又与人流感病毒香港分离株有较高的同源性(均为99.4%)。交叉血凝抑制试验显示，S3株与其他3毒株抗原性差异明显。鉴于猪在流感病毒传播与复制间的特殊地位，应密切监测猪流感。

关键词：猪流感病毒；HA基因；克隆；抗原性分析

猪流感病毒(Swine influenza virus， SIV)属正黏病毒科病毒，A、B和C3型的流感病毒都可以感染猪，引起猪流感(Swine influenza，SI)的发生。目前已发现的A型SIV有H1N1、H1N2、H1N7、H3N2、H3N6、H4N6、H5N1和H9N2等8种不同血清亚型。A型流感病毒不但感染禽，而且可以感染猪，如1998年香港暴发的猪流感是由中国南方禽流感病毒突破种间屏障从禽传到猪。目前，我国流行SI的血清型主要有人源H3N2、猪源H1N1和类禽源H1N13种[1]，其中以H3亚型为主。

流感病毒的HA蛋白是病毒囊膜上的2种糖蛋白纤突之一，具有亚型特异性，并可诱导动物产生中和抗体，是流感病毒的主要保护性抗原，在病毒入侵宿主细胞的过程中起着重要的作用，其裂解位点的氨基酸序列直接决定着流感的组织嗜性与致病力[2]，HA蛋白在病毒感染的过程中，起识别和吸附宿主细胞受体的作用，是宿主特异性的决定因素[3]。对HA基因进行分析，有助于了解病毒的遗传演化背景。由于HA基因极易发生变异，故对其特性的研究具有十分重要的意义。同时，基于HA的各种流感病毒基因工程重组疫苗已成为目前流感防控的热点[4]。

猪流感在猪群中的流行日渐严重，呈现不断蔓延的趋势，H3亚型在全国范围内流行[5­6]。由于H3亚型流感病毒也是人流感病毒的一个主要亚型，因而引起了广泛的关注，这不仅在于其显而易见的兽医传染病学意义，更在于其潜在的公共卫生学意义，以及在流感病毒分子流行病学及“禽­猪­人”种间传播中不可替代的特殊地位和作用。

1　材料与方法

1.1　病毒和血清

A/Swine/Guangdong/BXL/2003(H3N2)株简称BXL株，A/Swine/Guangdong/P4/2003(H3N2)株简称P4株，A/Swine/Henan/S3/2003(H3N2)株简称S3株，A/Swine/Shandong/S4/2004(H3N2)株简称S4株；S4株猪流感病毒高免血清和8份，人源H3N2亚型流感病毒血清HI均为1∶256，分别记作A1～A9，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室保存。

1.2　载体和菌种

pMD18­T克隆载体和DH5α大肠埃希菌感受态细胞，购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3　分子生物学试剂

RNA提取试剂Trizol、禽源反转录酶AMV购自Invitrogen公司；PCR扩增所用的Ex TaqDNA聚合酶购自宝生物工程(大连)有限公司；胶回收(小量)试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司。

1.4　病毒RNA的提取及cDNA的制备

采用TRIzol试剂分别从含有4个毒株的鸡胚尿囊液中提取病毒RNA；以Uni­12：5′­AGCAAAAGCAGG­3′为引物，采用禽源反转录酶AMV，按试剂盒说明书进行反转录合成各自的cDNA。

1.5　HA基因的RT­PCR扩增

HA基因RT­PCR扩增引物序列如下：

上游引物：5′­AGGGCGTCTCAGCAAAAGCAGGGGA­3′。下划线部分为引入的BsmBⅠ酶切位点。下游引物：5′­TATTGGTCTCTGGGAACAAAGATGA­3′。下划线部分为引入的BsaⅠ酶切位点。

PCR反应程序：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s,54 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min，循环扩增30次；72 ℃ 10min。PCR产物采用上海华舜公司胶回收试剂盒回收。

1.6　连接与转化

将各自胶回收的PCR产物与pMD18­T载体连接后，转化DH5α大肠埃希菌感受态细胞，然后取出100μL菌液涂布于含有氨苄青霉素(50 μg/mL)的LB平板上，37 ℃培养16 h。挑取白色单个菌落，接种于5mL含有氨苄青霉素(50 μg/mL)的LB液体培养基中，37 ℃培养12 h。

1.7　重组质粒的鉴定

将经过培养的菌液进行PCR扩增，产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.8　目的基因测序

将鉴定为阳性的菌液送Invitrogen公司进行序列测定。

1.9　抗原性测定

用A1­A9对4个毒株进行交叉血凝抑制试验。

2　结果

2.1 HA基因的RT­PCR

4个毒株RT­PCR扩增产物经10 g/L的琼脂糖凝胶电泳，扩增的片段约1 700 bp，与预期大小相符(图1)。

2.2　重组质粒的PCR鉴定

菌液进行PCR扩增鉴定，得到一条约1 700 bp的特异条带，与预期目的条带大小相符，说明重组质粒构建成功(图2)。

1.DNA标准DL 2 000；2.阴性对照；3～6.BXL、P4、S3和S4 4个毒株HA基因RT­PCR结果

1.DNA Marker DL 2 000；2.Negative control；3­6.HA gene products ofBXL，P4，S3 and S4

图1　4个毒株HA基因RT­PCR扩增结果

Fig.1　RT­PCR products of HA gene of four strains

1.DNA标准DL 2 000；2～5.BXL、P4、S3和S4 4个毒株HA基因PCR扩增鉴定结果

1.DNA Marker DL 2 000；2­5.HA gene products of BXL，P4，S3 and S4

图2　4个毒株HA基因PCR鉴定结果

Fig.2　Identification of HA gene of four strains by PCR

2.3　HA基因序列比较分析结果

通过序列分析发现4个毒株间总共有14个碱基发生变化，核苷酸同源性为99.4%～99.7%，氨基酸同源性为98.2%～99.3%。绘制的进化树见图3。

2.4　抗原性测定结果

A1～A9对4个毒株均产生血凝抑制作用，各自的HI效价见表1。

图3　H3N2亚型猪流感病毒HA基因进化树

Fig.3　Phylogenetic tree of HA gene of H3N2 SIV

表1　交叉血凝抑制试验结果

Table 1　The results of cross­hemagglutination inhibition test

3　讨论

本研究成功对BXL、P4、S3、S44个毒株的HA基因进行了序列测定。通过与GenBank中的参考毒株比较发现，4个毒株均与1999年香港流行的人流感和2003年的广东猪流感有很高的同源性(都在99%以上)，既为猪流感病毒HA基因可能来源于人流感基因提供了证据，又说明4个毒株可能由参考毒株进化而来或者它们有共同的祖先，只是近段时间突变的频率有所减弱。

对绘制的进化树进行分析，根据Nerome K等[7]和Zhou NN等[8]的分类标准，本研究的4个毒株与A/Moscow/10/1999(H3N2)和A/HongKong/1144/1999(H3N2)处于一个大分支中，所以这4个毒株都属于近代人流感谱系。进一步分析，2株来源于广东的毒株BXL株和P4株处于同一分支上，与A/Swine/Guangdong/1/2003(H3N2)起源于同一大的分支上，说明两年来广东流行的该亚型的流感病毒比较稳定，重组频率不大。而来源于山东的S4株与3株广东毒株处于相近的一个大分支上，尽管处于不同地域，但在同一时期毒株进化关系密切，说明它们有共同的祖先，只是各自在进化过程中发生了微小的突变。来源河南的S3株与A/Swine/Guangdong/6/2004(H3N2)处在一个大的分支上，说明2004年我国流行的猪流感病毒可能来源于同一祖先，并且变异不大；又因为和A/NewYork/247/1998(H3N2)处在一个大的分支上，说明该流感病毒可能由人流感病毒而来。正如CapuaI等[9]的研究指出的，可能经由鸟类的活动，将该病毒引入我国，进而感染猪，具体机制还不是很清楚，有待进一步深入研究。

目前，还没有SIVHA切割位点氨基酸组成与毒力之间关系的报道，但若以高致病力禽流感病毒的分子特征为标准(R­X­R/K­R↓G),4株流感病毒切割位点处序列(PEKQTR↓G)不符合高致病力毒株的分子特征，提示4个毒株为非高致病力毒株，这样病毒就只能被那些仅存在于消化道或呼吸道的蛋白酶或细菌酶识别并切割，往往只能引起消化道或呼吸道的局部感染。

MatrosovichM等[10]研究发现，HA糖基化位点的增加会降低流感病毒与细胞受体的亲和力和病毒释放能力。HA1和HA2裂解位点处多一个碱性氨基酸的插入和糖基化位点的缺失均能使HA对蛋白酶切割的敏感性增强，而使致病力提高。本研究4个毒株均含有9个N­糖基化位点，分别位于HA的第8、22、38、63、126、133、165、246和483位，与参考毒株一致；裂解位点处未发现有糖基化位点增加的现象，而且裂解位点处的碱性氨基酸也并没有增加，所以可推测这4个毒株在致病性方面较参考毒株不会有太大变化。

H3亚型猪流感病毒HA上的受体结合位点(RBS)呈口袋状，RBS的氨基酸组成变异分析结果表明，在全球所有分离株中，RBS的底部98位的Y、前壁134位的G和136位的S均恒定不变，底部153位和前壁第132位保守程度很高，说明这些位点的氨基酸对于病毒和受体结合的功能十分重要，是病毒与受体相互作用的主要因素，与病毒的增殖和生理功能等生命活动有重要的关系，左侧壁第226位和前壁第133和135位高度变异[11]。本研究的4个毒株与参考毒株比较，在第226位、133位与135位的氨基酸均未发生变化。有研究指出，由于猪体细胞的特殊性，即在其表面具有两种介质——可与人流感病毒粒子结合的唾液酸α2、6­半乳糖苷和可与禽流感病毒粒子结合的唾液酸α2、3­半乳糖苷，当猪流感病毒第226位的氨基酸为Met时，病毒就具有感染禽的的潜力。而这4个毒株均未出现这种现象，所以不至于引起禽类感染。

研究已知，H3亚型流感病毒HA上有5个抗原决定簇(即A、B、C、D、E)，且主要位于重链(HA1)上。A位于由140位～146位氨基酸形成的突出环上及133位～137位氨基酸；B位于155位上面的主环(150～160)及球区末端围绕α螺旋结构的187位～198位氨基酸；C位于球区下方53、54、275和278所在的区，由52位Cys与277位Cys间二硫键相连所形成三维结构的膨胀部；D位于HA三聚体交界处，由207和174位等表面氨基酸组成；E是由63、78、81位和83位形成的表面氨基酸区。上述抗原决定簇的氨基酸发生替换，一般均会引起HA蛋白的抗原性漂移[11]。交叉血凝抑制试验结果显示，S3株HI明显高于其他3个毒株。对编码S3株流感病毒抗原表位的氨基酸分析发现，其HA1的161、174和175位发生突变，不同于其它3个毒株，这可能是导致抗原性差异出现的原因。

因此，应加大对流感病毒抗原性变异的研究，加强对流感病毒变异的监测，提高对流感病毒流行趋势的预测能力，为流感疫苗株的筛选奠定基础。