西安市部分养鸡场AIV H5疫苗免疫后血清抗体监测与分析

摘　要：为了解西安市养鸡场禽流感疫苗免疫后抗体产生情况，从西安市长安区、周至县、高陵县等区县父母代和商品代养鸡场采集血清2626份，采用血凝试验和血凝抑制试验检测抗体滴度，经过检测，抗体合格率达84.3%；并对采集样品鸡群的免疫状况进行分类分析，结果表明免疫后3周～9周为抗体持续稳定期，10周后抗体水平开始下降；禽流感疫苗免疫2次～3次的鸡体内可产生较高水平的抗体。

关键词：禽流感；抗体监测；分析

禽流感(Avianinfluenza，AI)是由A型流感病毒引起的一种禽类感染或疾病的综合征[1]。其主要症状表现为从亚临床感染到轻重度的呼吸道感染，产蛋下降甚至严重致死性疾病，其严重程度取决于病毒毒株及被感染禽的种类，日龄和有无并发症等因素[2]。其中H5和H7两个血清型可以引起高致病性禽流感(Highpathogenic avianinfluenza，HPAI)，以传播快、发病快、死亡率高为特征，常可导致感染鸡群的全军覆没，造成严重的经济损失，被世界动物卫生组织列为A类烈性传染病，并被列入国际卫生武器公约动物类传染病名单[3]。高致病性禽流感已成为世界养禽业最重要的疫病之一[4]。自1997年香港发生H5N1高致病性禽流感以来，H5N1禽流感蔓延至亚洲、欧洲、并首次发生于非洲，同时人感染病例仍在不时出现[5]。为了控制疫情的扩散，我国采取了疫区内家禽进行扑杀、销毁、封锁及在疫区周围进行紧急免疫接种建立免疫带和在全国推行禽流感强制免疫接种等综合防控措施，取得了良好的预防和控制效果[6]，疫苗免疫是预防禽流感的有效措施[7-10]。为了解西安市H5禽流感免疫情况，近来对该市鸡群进行了抗体监测，为进一步做好H5高致病性禽流感免疫工作提供依据。

1　材料与方法

1.1　样品

在全市父母代种鸡场、商品代鸡场120个鸡群进行采样。样品来自户县、高陵县、长安区、莲湖区、周至县、闫良区、蓝田县、未央区等地区，共采集样品2626份，这些抽样鸡只全部免疫接种过H5型高致病性禽流感油乳灭活疫苗，采血采用翅静脉采血，分离血清。采样情况见表1。

表1　样品采集情况表

Table 1　Number and distribution of samples collected

所有鸡场均按1%比例抽取血清样品，每场不少于10份，每个样品采血量2 mL。

1.3　试剂和仪器

1.3.1　1%鸡红细胞　用一次性采血器吸取38 g/L的枸橼酸钠溶液(其用量为所需血量的1/5)，从非免疫鸡翅静脉采血，用pH7.2的0.01 mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)以2 000 r/min，离心，弃上液，反复洗涤3次后，配成1%红细胞悬液。

1.3.2　H5型禽流感抗原及阳性血清　由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供，效价为 1∶2 048。

1.3.3　仪器　96孔“V”形微量反应板，定量移液器(25 μL)，滴头，微型振荡器，恒温箱，离心机等。

1.4　检测方法

用血凝试验(HA)检测所购买的禽流感标准抗原的血凝价，然后制备4单位抗原，采用血凝抑制试验(HI)检测血清样品中的抗体效价。血凝试验和血凝抑制试验均按照参考文献中微量法进行[11]。

1.5　结果判定

以完全抑制4单位抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度。HI效价≤3log2判阴性，HI效价等于4log2为可疑，进行重复试验，HI效价≥5log2判阳性，判定为抗体合格。

2　结果

2.1　抗体合格率

经检测，父母代鸡场采集样品1 095份，合格血清927份，抗体合格率84.7%；商品代鸡场采集样品1 531份，合格血清1285份，抗体合格率83.9%(表2)。

表2　抗体监测结果

Table 2　The results of antibody

根据监测时，疫苗注射时间分析，疫苗注射3周后，抗体水平基本可以达到6log2,3周～9周维持较高水平，12周抗体水平开始下降，与张改智等[13]报道的免疫后5周～7周抗体水平达到高峰基本吻合。检测结果按照抗体滴度分布，其中5log2和6log2比例较大(表3)。

表3　免疫接种时间长短与抗体水平

Table 3　The relationship between inoculation time and antibodylevels

对照采样记录及免疫档案，采集样品鸡群大多采取如下免疫程序：14日龄左右初免。剂量0.25 mL；28日龄左右二免，剂量0.5mL；60日龄左右第3次免疫，剂量0.5mL；根据免疫注射次数与抗体关系分析，免疫2次～3次抗体水平较高，持续时间较长，与陆昌海等[123]报道一致(表4)。

表4　疫苗注射次数与抗体水平

Table 4　The relationship between inoculation times and antibodylevels

通过对西安市13个区县120个养鸡场共2626份鸡血清样品进行了免疫抗体测定，从监测结果表明，父母代和商品代养鸡场均获得较高免疫抗体水平，其采用的免疫程序比较合理。从监测结果分析可知，禽流感每年免疫2次～3次才可以获得可靠的免疫抗体。

本次检测中有638份样品，只进行了首次免疫，分别是免疫后14 d～27d所采取的血清样品，抗体水平较低，仅有206份合格，这可能与油乳剂灭活苗本身特性有关，油乳剂苗首次免疫产生抗体较慢，效价较低。在经过2次～3次免疫后，仍有部分样品抗体水平低于24次，这可能是由于免疫应答受到很多遗传和环境因素影响，并不是所有免疫个体都产生良好免疫应答，因而在对鸡群进行免疫抗体监测时，样品的数量要尽可能大，以减少这种未产生免疫应答的鸡对检测结果的影响。

检测中仍然发现部分个体抗体滴度较低，分析原因可能有：①免疫疫苗保存不当，免疫注射操作不规范。由于西安市个别区县较偏远，交通不便，保存疫苗的条件不好，造成疫苗性状发生变化，如灭活油乳苗分层，或者注射疫苗隔日仍然使用，或者注射剂量不准等。②饲养管理水平是决定抗体水平的重要相关因素。对于卫生条件较差的养鸡场，抗体持续水平和免疫后抗体滴度均匀度都较差。③免疫抑制性病原微生物感染，如传染性脊髓炎脑炎、传染性法氏囊等，均会造成免疫系统机能受损，不能对疫苗产生正常应答[14]。④禽流感抗体监测工作是评价和指导防控工作的重要举措，在做好抗体监测，保障良好的群体抗体水平的同时，还应该重视养禽业大系统的其他环节，建立积极主动、行之有效的综合防控体系，实行家禽(畜)养殖经营准入，立法规范家禽及其产品流通与监管工作，改善现有水禽生产方式，防止污染水体和野禽接触等措施[15-16]，对禽流感防控工作有重要意义。