摘 要：牛病毒性腹泻病毒(BVDV)引起牛病毒性腹泻-黏膜病，广泛分布于世界各地。该病毒具有较大的变异性，根据病毒基因组结构特点分为2个基因型，即BVDV1和BVDV2。每个基因型包括多种基因亚型，每个基因型又有2个生物型，致细胞病变(CP)型和非致细胞病变(NCP)型。病毒的这种特性造成各病毒株的抗原性和血清学特性的差异，给疫病的流行病学研究、诊断、疫苗研究和防控工作造成一定困难。文章论述了病毒的这种特性造成疫病的多种临床表现，导致疫病防控困难，说明了流行病学分析在该病防制的重要性，提出疫病主要诊断方法及防控措施。
关键词：牛病毒性腹泻；多型性；防控
牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)是引起牛的重要疫病病毒性腹泻-黏膜病(Bovineviral diarrhea-mucosaldisease，BVD-MD)的病原，该病毒属于黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)。在分类上与猪瘟病毒(Classicalswine fever virus，CSFV)和边界病毒(Border diseasevirus，BDV)同为一属，并与其同源性较高，抗原性有交叉。病毒可感染牛、羊、猪等多种家畜，以牛为主。受感染牛可表现为多种临床症状，如肺炎、腹泻、流产、出血性综合征等急性感染及持续性感染。该病分布广泛，世界大多数养牛国家都存在，给世界养牛业造成了巨大的经济损失[1]。
BVDV是单股正链RNA病毒，有囊膜，基因组长约12.5 kb，由5′UTR(大约380 nt)，一个长的开放阅读框(openreadingframe，ORF)，编码病毒的结构蛋白，包括病毒的衣壳蛋白和囊膜蛋白(Erns、E1和E2)和非结构蛋白，和3′UTR组成。根据病毒基因组5′UTR或E2序列比对结果，BVDV分两种基因型和多种基因亚型，每种基因型都有两种生物型，即致细胞病变型(cytopathogenic，CP)和非致细胞病变型(non-cytopathogenic，NCP)[2-3]。这些差异导致不同毒株的抗原性和致病性的不同。掌握这些基因分型在实验室诊断、流行病学研究、疫苗研制乃至疫病的控制和消灭等方面都具有重要的意义。
1 病毒分型
BVDV具有较大的变异性，根据病毒的基因组差异及其在细胞培养方面的生物学特性的不同，将BVDV分为不同的基因型和生物型。
病毒基因型是根据病毒某些特有的序列来进行划分，一般通过序列中最保守区域或者最不保守区域比较分析，理想的基因分型能够反映出病毒的抗原差异及地域差异，利于病毒的免疫学和流行病学研究。瘟病毒最保守的区域是5′UTR，通过分析5′UTR，BVDV分为BVDV1和BVDV2两个型。2002年，国际病毒学分类委员会正式将病毒的分类地位予以确定，分为两个基因型。二者核苷酸差异率在25%左右，BVDV1和BVDV2基因组的E2基因的N端氨基酸差异率在40%左右。目前，所有病毒株都根据其基因组的某个区段的不同归属为这两个型。BVDV1根据其基因组差异，病毒分离株又可分11个不同的基因亚型1a～k，主要的流行亚型是1a和1b[4]，这两个基因亚型5′UTR差异率在10%左右，E2蛋白N端氨基酸差异率30%左右，二者有诸多的相似和不同。
两个基因型血清学反应存在差异，研究表明，针对BVDV OregonC24V株NS2-3蛋白的单克隆抗体能够跟所有的BVDV发生反应100%(49/49)，针对E2蛋白的单克隆抗体变化较大，从而也说明E2蛋白的变异率较高。针对CSFVBaker A株Erns的单克隆抗体有63.3%(31/49)能与BVDV反应[5]，而针对E2蛋白的单克隆抗体几乎不跟BVDV毒株反应，为BVDV与CSFV的鉴别诊断提供了很好的方法，而且将几种不同的单克隆抗体联合应用，可以建立CSFV滴度评价体系，为CSFV疫苗研制提供理论基础。针对BDV87/6 株E2蛋白的单克隆抗体有53.1%(26/49)与BVDV反应，并且通过单克隆抗体可以区分两种基因型病毒株。
生物分型依据是病毒在细胞培养上能否致细胞病变，分为CP型和NCP型。CP型在细胞上表现明显的细胞病变(CPE)，而NCP型则不表现CPE，但不能依此断定CP型病毒为强毒，许多研究表明，在自然界中分离的病毒主要以NCP型为主，因此认为NCP型是病毒在自然界存在的正常型态。NCP型可以转化为CP型，二者转化是BVDV在自然界得以生存的方式，其转化机制可能是细胞RNA的插入，或者是病毒基因组RNA发生重排、缺失和突变，使NCP型病毒转化为CP型病毒[6]。
2 病毒的致病性
在致病方面，BVDV1和BVDV2均可表现出轻微临床或亚临床感染[7]。
早在1946年，美国纽约州就有BVD-MD的报道，但是直到50年代初才分离到第1株病毒确定为BVDV,1994年，美国和加拿大首次从出现病毒血症的病牛中分离到毒性较强的BVDV，通过分子手段分析基因组5′UTR，证实其属于另外一个基因型即BVDV2，流行病学分析表明，BVDV1b流行更为普遍，更多的引起牛的肺炎性死亡[8]。然而，各个基因型的亚型间在血清学反应没有显著的差异，这可能是由于基因亚型分型是根据不编码病毒抗原的5′UTR分析得出。我国缺少对该病的系统研究，目前的基因分型还不太清楚，就目前已有的研究资料来看，我国在1984年首次从流产胎儿中分离到一株BVDV，即CC-184，在1995年从疑似猪瘟的猪体内分离到另外一株BVDV，即通常的ZM-95，这两个毒株都属于BVDV1型[9]。20世纪90年代初，美国和加拿大首次证实了BVDV2的存在，该病毒引起牛急性出血性综合征，死亡率高达25%，远远高于以前由于BVDV1引起的死亡率。近些年来，世界上许多国家都有该基因型的报道[10-13]。
BVDV2强毒引起的牛只死亡率在50%～60%，其临床症状往往比较严重，比如高热、腹泻、白细胞减少，甚至死亡，而弱毒感染的临床症状比较轻微[14]。BVDV可引起牛的繁殖障碍疾病，其比例逐渐增大。怀孕牛在妊娠150d前感染NCP病毒时，容易发生流产、死产等；正常产下的胎儿易产生持续性感染，持续性感染牛本身没有临床症状，而且终生带毒、排毒，感染病毒能逃避宿主的免疫反应，如细胞凋亡、产生干扰素等，在体内低水平复制。持续性感染动物是疫病传播最为重要的病源之一，因此预防病毒的持续性感染是疫病防控的主要环节[15]。
从生物型角度看，两个生物型都能引起牛发病，但其流行程度不尽相同。譬如引起毒血症的病原为NCP型BVDV2，与BVDV1相比，BVDV2能够引起严重的病毒血征[16]，然而根据病毒株的毒力、致病性和基因分型表明，BVDV2表现出不同的差异性，由此表现出不同的临床症状，或者轻微，或者出现严重的病毒血症。
3 牛病毒性腹泻的防控
疫病的防控围绕根除和控制展开，根除是从某一个国家或者地区完全消灭病毒；控制是有病毒的存在，但是通过多种手段使疫情处于可控范围，造成的经济损失降到最低。根据各国国情和经济实力的不同，动物疫病防控措施也不尽相同。
BVD是养牛业重要疫病之一，临床症状多样化。其防控措施主要有两个，一是鉴别和扑杀持续性感染动物，另外就是免疫接种[17]。综合应用上述措施是控制和最终消灭该病的重要保证，应根据国家的经济状况和养牛业发展水平，制订不同的防疫对策。在不发达国家主要采用疫苗接种的方式来防控该病；发达国家则采用第一种方法，欧洲某些国家通过鉴别和扑杀持续性感染动物成功地消灭了该病，有的国家正在实施疫病根除计划，并取得了较好的效果[18-22]。疫苗用于BVD防控已有30多年的历史，并进行了深入的研究。实践表明，疫苗的合理应用能够有效减少疫病发生，降低经济损失。目前，最为有效的疫苗是灭活疫苗和弱毒疫苗，灭活疫苗对怀孕牛安全，但是其免疫期短，比弱毒疫苗制造成本高，而弱毒疫苗免疫期长，却可能对怀孕牛不安全，因此，如何正确使用这两种疫苗有效地防控该病是人们面临的问题之一。但截止目前，还没有一种标准化的商业疫苗。
早期研制的疫苗主要是预防该病的急性死亡性感染，以减少临床感染，降低经济损失为目的。然而，后来人们发现，并不是每头感染牛都是急性病例，只有持续性感染的牛才会导致致死性黏膜病，因此，控制持续性感染是当时的防控重点。1994年，美国和加拿大发生了牛的致死性病例，最后确诊的病原是BVDV2，而并不是传统的BVDV1，使人们重新认识到该病毒的复杂性，于是随后研制疫苗的主导思想是既防制持续性感染又防止急性感染。由于病毒感染造成牛的免疫抑制、免疫力降低导致的多病原混合感染病例时有发生，因此，包含多种病毒抗原的多联疫苗是目前疫苗研制的主要趋势。目前，已有的商业化疫苗包括有牛传染性鼻气管炎、牛副流感3型和牛呼吸道合胞体病毒等组分[23]。
从病毒的根除目的来看，简单的利用疫苗防控该病的临床症状远远不够，检疫和清除持续性感染牛是防控该病的中心环节。怀孕牛在90d前感染BVDV往往导致牛的死产和木乃伊胎，不为人们重视和注意；110d前感染BVDV，产下的牛犊可能成为持续性感染牛。检测方法是从血液中分离病毒，也可以利用免疫组化方法检测皮肤组织的病毒粒子，持续性感染动物一般没有血清特异性抗体。3月龄前存在母源抗体，能够检测出抗体。年龄较大的持续性感染动物由于疫苗免疫或自然感染其他与持续性感染病毒抗原性不同的病毒，会检测出低水平的抗体滴度，持续性感染动物的确诊需要经过2次复检，一般间隔3周进行。因此，在管理上注意牛的严格隔离检疫，种公牛精液检测BVDV阴性方可配种，母牛在怀孕前也应该检测BVDV是否是血清阴性。
持续性感染动物可导致发生致死性的黏膜病，而且感染动物没有临床表现，但可以向外排毒，是疫病传播的重要来源，因此，鉴别并扑杀持续性感染动物是减少经济损失乃至根除疫病的重要措施。
流行病学研究是疫病防控及疫苗研制的基础。流行病学监测应贯穿于整个疫病防控过程中，包括疫情监测和免疫水平监测。疫情监测包括病毒的血清型、流行范围及致病力的强弱等，为追溯疫源、了解本地区疫情动态提供数据，为疫病的防控提供科学依据。因此，必须保证疫情监测和报告的时效性和主动性，保证疑似病例及时送往专业实验室进行诊断。目前，世界上许多养牛业发达国家都建立了该病的流行病学资料。
我国尚未对该病进行深入研究，其流行病学资料也不完全，其防控未引起有关部门重视，未纳入国家疫病防控体系中。尽管有些单位对该病进行了一些研究[24]，但未形成该病的研究体系。没有商品化疫苗投入使用，有资料表明猪瘟兔化弱毒疫苗对BVD-MD的防制有较为理想的效果，然而，其防控机理有待研究，尚不能与国家防控体系相融合，难以推广应用。因此，及早研制和生产用于BVD-MD防控的疫苗产品，是疫病防控和最终消灭所必需。
4 牛病毒性腹泻的诊断
诊断是疫病防控的基础，主要有以下3个目的，①评价畜群BVDV流行状况；②鉴别和确定畜群BVDV感染动物；③剔除BVDV阳性动物。
诊断方法有多种，主要有病毒分离、血清中和试验、免疫荧光试验、ELISA及RT-PCR等[25]。
病毒分离是最基本的方法，无菌采集发病牛的血液、鼻拭子及组织脏器(肺、肝脏、脾脏、肾脏及淋巴结等)，采集的病料置于冰上低温保存，并尽快送往实验室，经过适当处理后在牛源细胞，如MDBK等培养进行病毒分离。病毒分离是检测牛感染BVDV最经典的方法，但是该方法费力、费时。
血清中和试验和荧光抗体试验在BVDV的流行病学调查、疫病检测方面具有重要作用，因为NCP型BVDV可引起持续性感染，没有临床症状。
RT-PCR方法通过设计好的特异性引物来扩增特异性片段，该方法敏感性高，不仅可以用来诊断BVDV，也是流行病学病毒分型的主要手段。
5 总结
尽管BVD-MD是影响养牛业重要的经济疫病，然而由于该病不像口蹄疫和禽流感等给人们留下深刻的印象，引起的疾病临床症状轻，也不存在公共卫生问题，因此在世界范围内，该病往往很少引起人们的重视。然而，随着养牛业的发展，该病对牛的影响也凸现出来，该病逐渐被人们认识和熟知，世界动物卫生组织(OIE)也逐渐重视该病的防控。
动物疫病的防控是一个复杂庞大的体系，包括饲养水平、管理水平、疫病病原学、流行病学、诊断学及疫苗学等的综合应用。我国应尽快建立起BVD-MD的整套防疫体系，为保障我国畜牧业健康发展奠定基础。